Afledning og differentiering af Canine æggestokkene mesenkymale stamceller
Summary
Heri, beskriver vi en metode til isolering, udvidelse og differentiering af mesenkymale stamceller fra canine æggestokkene væv.
Abstract
Interesse i mesenchymale stamceller (msc) er steget i det sidste årti på grund af deres lethed af isolation, ekspansion og kultur. For nylig, har undersøgelser vist bred differentiering kapacitet, at disse celler besidder. Æggestokken repræsenterer en lovende kandidat til celle-baserede behandlinger skyldes, at det er rig på MSC’er, og at det ofte kasseres efter ovariectomy operationer som biologisk affald. I denne artikel beskrives procedurer for isolation, ekspansion, og differentiering af MSCs afledt af canine æggestokkene, uden nødvendigheden af celle-sortering teknikker. Denne protokol udgør et vigtigt redskab for regenerativ medicin på grund af den brede anvendelighed af disse meget differentiable celler i kliniske forsøg og terapeutiske bruger.
Introduction
Antallet af offentliggjorte undersøgelser, at fokus på stamceller er steget betydeligt i det sidste årti, en forskningsindsats, der har fået næring af det kollektive mål for at opdage kraftfulde regenerativ medicin behandlinger. Stamceller har to primære definerende markører: self – renovering og differentiering. Mesenkymale stamceller er ansvarlige for regelmæssig væv omsætning og har en mere begrænset kapacitet på differentiering i forhold til embryonale stamceller1. For nylig, mange undersøgelser har vist en bred vifte af differentiering af MSC’er, og et emne under diskussionen er om forskelle mellem embryonale og voksne stamceller findes på alle2.
Ovarium overflade epitel er en uforpligtede lag af celler, relativt mindre differentierede, som udtrykker både epitel og mesenchymale markører3, bevarer evnen til at skelne i forskellige typer af celler som reaktion på miljømæssige signaler4. Den nøjagtige placering af stamceller i æggestokken er ikke kendt; Det er blevet foreslået, at bipotential ophav i tunica albuginea giver anledning til kønsceller5. Immunologiske undersøgelser har den hypotese, at disse celler har en stromale oprindelse6 eller er placeret i eller proksimalt for æggestokken overflade7. Da mesenkymale stamceller express talrige receptorer, der spiller en vigtig rolle i celle vedhæftning8, var et eksperiment designet til at teste hypotesen om, at du vælger en befolkning af celler med hurtige vedhæftning ville isolere en befolkning af celler klart characterizable som mesenchymale i naturen. For nylig, vores gruppe rapporteret afledning af MSCs fra æggestokkene væv baseret på deres kapacitet af adhæsion kultur parabol i de første 3 h af kultur, plastik overflade for at opnå en renset befolkning af cellerne udviser hurtig vedhæftning9. Her beskriver vi udviklede metoden for mesenkymale stamceller isoleret fra æggestokkene væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri dokumentere vi at MSC’er kan isoleres fra canine æggestokkene væv, der betragtes som biologisk affald efter ovariectomy. At mange celletyper kan findes i æggestokken, foreslog vi en protokol for at vælge MSCs baseret på deres hurtige overholdelse af plast, som med held har valgt celler, der voksede i en éncellelag med en fibroblast-lignende morfologi.
Den første rapport af afledning af MSC fra knoglemarven var baseret på plast vedhæftning kapacitet af MSCs i løbet af de første …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender canine sterilisation programmet på UNESP-FCAV for venligst at give æggestokkene. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra FAPESP (proces no. 2013/14293-0) og KAPPER.
Materials
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
Referências
- Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).
- Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
- Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
- Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
- Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
- Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
- Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
- Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
- Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
- Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).
