التحديد الكمي لمصنع البروتين للذوبان والهضم الكربوهيدرات المحتوى، استخدام الذرة (ميس زيا) كأنموذج
Summary
توفر البروتوكولات المبينة في هذا التقرير منهجية واضحة وودود لقياس البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات (غير الهيكلية) الهضم في الأنسجة النباتية. القدرة على التحديد الكمي لهذه المغذيات النباتية اثنين الكبيرة آثار هامة للمضي قدما في مجالات فسيولوجيا النبات والبيئة الغذائية، وتفاعلات النبات العشبي والإيكولوجيا الشبكة الغذائية.
Abstract
بيانات عنصري تستخدم عادة للاستدلال على نوعية النبات كمورد لأكلات العشب. بيد أن في الزمان والمكان للكربون في الجزيئات الحيوية، ووجود المركبات الدفاعية النبات المحتوية على النتروجين، والتباين في إبلاغها الارتباطات بين النيتروجين ومصنع البروتين محتوى كل تحد دقة هذه الاستدلالات. بالإضافة إلى ذلك، ركزت البحوث على النباتات و/أو تتطلب فسيولوجيا عاشب المعمم على مستوى دقة التي لا تتحقق باستخدام الارتباطات. الأساليب المقدمة هنا نقدم الباحثين بروتوكول واضح وسريع لقياس مباشرة مصنع البروتينات القابلة للذوبان وهضم الكربوهيدرات، المغذيات الكبيرة مصنع اثنين ترتبط الأكثر ارتباطاً وثيقا بأداء الفيزيولوجية الحيوانية. البروتوكولات الجمع بين فحوصات قياس الألوان تتسم جيدا مع خطوات المحسنة الخاصة بمصنّع الهضم لتقديم نتائج دقيقة واستنساخه. لدينا تحليلات مختلفة من الذرة الحلوة الأنسجة وتظهر هذه فحوصات حساسية للكشف عن الاختلاف في مصنع البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم عبر مستويات مكانية متعددة. هذه تشمل الاختلافات بين النباتات عبر زراعة المناطق والأنواع النباتية أو أصناف، فضلا عن داخل المحطة الاختلافات في نوع النسيج والاختلافات الموضعية حتى داخل النسيج نفسه. الجمع بين البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم مع البيانات عنصري أيضا لديه القدرة على توفير فرص جديدة في علم الأحياء النباتية لتوصيل تغذية النبات المعدنية مع العمليات الفسيولوجية النباتية. كما تساعد هذه التحليلات توليد البروتين للذوبان والهضم الكربوهيدرات البيانات اللازمة لدراسة الإيكولوجيا التغذوية، والنبات العشبي التفاعلات والديناميات الشبكة الغذائية، مما سيعزز بدوره الفيزيولوجيا والبحوث الإيكولوجية.
Introduction
الكتلة الحيوية النباتية تشكل الأساس للشبكات الغذائية الأرضية كلها تقريبا. الحصول على العناصر الغذائية من التربة عن طريق نظم جذور النباتات والاستفادة من أشعة الشمس في أنسجتها ورقي توليف الجزيئات الحيوية. على وجه الخصوص، الكربون والنيتروجين وتستخدم لإنشاء الكربوهيدرات، البروتينات (التي تتألف من الأحماض الأمينية)، والدهون اللازمة لبناء الكتلة الحيوية النباتية (أنه ينبغي ملاحظة أن في النبات فسيولوجيا غالباً ما يشير مصطلح “macronutrient” لعناصر التربة، مثل ن، ك ف وق، ولكن في جميع أنحاء هذه الورقة هذا المصطلح سيشير إلى الجزيئات الحيوية، مثل البروتينات والكربوهيدرات والدهون). عندما آكلات العشب تستهلك المواد النباتية، المغذيات الكبيرة الواردة في الأنسجة النباتية مقسمة إلى الأجزاء المكونة لها وتستخدم بعد ذلك لقيادة العمليات الفسيولوجية للمستهلك. وبهذه الطريقة، يكون المغذيات النباتية الكبيرة تأثيراً قويا على فسيولوجيا المستهلك جنبا إلى جنب مع آثار هامة على أعلى ترتيب التفاعلات الإيكولوجية وديناميات الشبكة الغذائية.
عبر مملكة الحيوان، بروتين قابل للذوبان والهضم الكربوهيدرات هي المغذيات الكبيرة ارتباطاً أوثق ل البقاء على قيد الحياة، والاستنساخ، والأداء1. وعلاوة على ذلك، تنظم غالبية الحيوانات بنشاط استهلاكهم من هذه المغذيات الكبيرة اثنين لتلبية تلك المتطلبات الفسيولوجية1،2. هذا صحيح بصفة خاصة للحشرات آكلات العشب التي تكشف عن تركيزات السكريات والأحماض الأمينية في الأنسجة النباتية، والتي بدورها توجه سلوك التغذية. نتيجة لذلك مصنع البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم قد لعبت دوراً قويا في تطور التفاعلات النبات-الحشرات.
بينما البيانات في مصنع البروتين للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم نادرة نسبيا (ولكن انظر6،7،،من89،،من1011)، هناك كثرة البيانات المتاحة بشأن محتوى عنصري النبات (الكربون والنيتروجين والفوسفور). هذا إلى حد كبير بسبب عناصر الدور أساسي في محطة التغذية المعدنية3،،من45. حيث يتم قياس العناصر، الارتباطات قد استخدمت لاستخلاص كمية البروتين للذوبان والكربوهيدرات القابلة الهضم، ولكن حسابات دقيقة غالباً ما يصعب الحصول عليها. على سبيل المثال، من المستحيل استخدام الكربون كمؤشر لمحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم النبات لأن الكربون أوبيكويتوسلي موجودة في جميع المركبات العضوية. وجود علاقة أقوى بين عنصري النتروجين ومحتوى قابل للذوبان بروتين النبات، وغالباً ما تستخدم عوامل التحويل النيتروجين للبروتين المعمم. ومع ذلك، هناك أدلة قوية على أن التحويلات النيتروجين للبروتين يتم إبلاغها الغاية12،13،14،15، مما يجعل من المحتمل استخدام التحويل المعمم غير دقيقة. وبسبب هذا، عوامل التحويل النيتروجين للبروتين غالباً ما تفتقر إلى الدقة، لا سيما بقدر ما مطلوب للدراسات التغذوية في آكلات العشب. أيضا، وجود النبات المحتوية على ن الليلوتشيميكالس، مثل قلويدات وجلوكوسينولاتيس التي غالباً ما تكون سامة لأكلات العشب، ويمكن الخلط بين هذه التحويلات.
وهنا، نحن نقدم اثنين الاختبارات الكيميائية لقياس تركيز البروتينات القابلة للذوبان والهضم من الكربوهيدرات في الأنسجة النباتية. وترد هذه الاختبارات بشكل منفصل، ولكن يقترح أن استخدامها في نفس الوقت لتحليل العينات النباتية نفسها بغية التوصل إلى تحليل أكثر شمولاً من المغذيات النباتية الكبيرة. كلا تستخدم منهجيات مماثلة، تتألف من خطوة الاستخراج، تليها الكمي عن طريق امتصاص. مصنع عينة الإعدادية أيضا متطابقة في كلا البروتوكولين، مما يجعل من السهل لتشغيل كل التحليلات بالترادف. الأداة المساعدة لهذه الاختبارات لا تنبع من تلك الجدة، كما أنها تعتمد على كبار السن، (برادفورد، جونز، دوبوا) الراسخة فحوصات قياس الألوان16،،من1718، لكن هنا قمنا بتنظيم واضح وسهل لمتابعة البروتوكول الذي يجمع بين هذه الأساليب مع التقنيات الخاصة بمصنّع استخراج أكثر غموضاً17،19 بغية جعل تطبيق هذه الاختبارات أكثر يسرا لتلك الموجودة في الميادين ذات الصلة بالنباتات.
لكلا فحوصات، يتم استخراج المغذيات النباتية الكبيرة أولاً ماديا بالتجميد، وليوفيليزينج، وطحن المواد النباتية. مقايسة البروتين للذوبان، كذلك يتم استخراج المواد الكيميائية،من1719 من خلال عدة جولات من فورتيكسينج والتدفئة العينات في محلول هيدروكسيد الصوديوم. ثم يتم استخدام مقايسة برادفورد معروفة، الاستفادة من أخذ G-250 الأزرق الرائعة، لتحديد كمية البروتينات القابلة للذوبان والبروتينية بين 3,000 5,000 دالتونس16،17. هذا التحليل قد كشف مدى بين 1-20 ميكروغرام مجموع البروتينات الواحدة الميكروسكوبية جيدا أو < 25 ميكروغرام/مل، ولكن لا قياس الأحماض الأمينية الحرة لا. خطوة الاستخراج من مقايسة الكربوهيدرات القابلة الهضم يستند إلى أسلوب حمض مخفف سميث et al. 20 ويسمح لعزل السكريات قابل للذوبان، والنشا، وفروكتوسان – لكن الكربوهيدرات غير الهيكلية. أسلوب القياس الكمي حمض الكبريتيك فينول مأخوذ من دوبوا et al. 18 والتدابير جميع أحادية الطور، اليغو-، والسكريات (، فضلا عن المشتقات الميثيل). هذا التحليل قادراً على تحديد كمية السكريات محددة، ولكن هنا نستخدم كمؤشر لمحتوى المجموع الكربوهيدرات القابلة الهضم (انظر سميث et al. 20 لتحليل أكثر تفصيلاً). معا، هذه فحوصات قياس اثنين من المغذيات الكبيرة التي ترتبط بشدة بأداء منظمة التعاون الاقتصادي-علم وظائف الأعضاء وحركيتها، توفير البيانات الهامة على نوعية الموارد في القاعدة الأرضية في الشبكات الغذائية النباتية. عرض هذه البروتوكولات يعزز توليد مصنع macronutrient مجموعات البيانات من أجل الحصول على فهم أكثر دقة لفسيولوجيا النبات وحركيتها التغذوية الإيكولوجيا، وتفاعلات النبات العشبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
عن طريق الجمع بين فحوصات اللونية راسخة مع البروتوكولات الفعالة الخاصة بمصنّع استخراج، توفير فحوصات أثبتت هنا طريقة معقولة ودقيقة لقياس البروتين النباتية القابلة للذوبان ومحتوى الكربوهيدرات القابلة الهضم. نتائج استخدام الذرة كأنموذج يوضح كيف يمكن استخدام هذه البروتوكولات للحصول على قي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وبفضل كل ما لدينا من المتعاونين الذين ساعدوا مع مجموعات حقل الذرة الحلوة، بما في ذلك ريسيج دومينيك وموت دان في جامعة ولاية كارولينا الشمالية، وبات بورتر في جامعة تكساس أية آند أم في لوبوك، تكساس. شكرا على كليسولد فيونا للمساعدة على تحسين البروتوكولات وتوفير عمليات التحرير على هذه المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في تكساس أية & م قاد جيم سلاير الزمالات الدراسية (قسم علم الحشرات) والتكنولوجيا الحيوية خطر التقييم برنامج منح تنافسية منح رقم 2015-33522-24099 من “وزارة الزراعة في الولايات المتحدة” (منحت للغاز و STB).
Materials
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
Referências
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. . The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , (2012).
- Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
- Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
- Chapin, F. S. The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
- Marschner, H. . Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants. , (1956).
- Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
- Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
- Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
- Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
- Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
- Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
- Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. 78, 105-109 (2002).
- Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
- Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
- Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
- Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
- Cui, S. W. . Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , (2005).
- Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
- Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
- Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
- Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
- Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
- Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
- Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
- Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).
