Определение активности фосфолипазы C в мозг огневки от пчелы
Summary
Чтобы проверить тормозящее действие фармакологических агентов на фосфолипаза C (PLC) в различных регионах мозга пчелы, мы представляем биохимического анализа для измерения активности PLC в этих регионах. Этот assay может быть полезным для сравнения PLC активность тканей, а также среди пчел, экспонирование различных поведений.
Abstract
Пчелы-организм модель для оценки сложного поведения и выше функции мозга, таких как обучение, память и разделение труда. Грибные тела (МБ) — выше мозга центр предложил быть нейронных субстрат поведения сложных пчелы. Хотя предыдущие исследования генов и белков, которые выражаются дифференцировано в MBs и других регионах мозга, деятельность белков в каждом регионе еще не понял полностью. Раскрыть функции этих белков в головном мозге, фармакологический анализ целесообразный подход, но сначала необходимо подтвердить, что Фармакологическое манипуляции действительно изменить активность белка в этих регионах мозга.
Мы ранее выявленные выше выражение генов, кодирующих фосфолипаза C (PLC) в MBs чем в других регионах мозга и фармакологически оценку участия PLC в поведении медоносных пчел. В этом исследовании мы биохимически проверили два фармакологических агентов и подтвердили, что они снижение активности PLC в MBs и других регионах мозга. Здесь мы представляем подробное описание о том, как обнаружить PLC деятельность в пчелы мозга огневки. В этой системе пробирного гомогенатах, полученных от различных мозга прореагировало с синтетическими fluorogenic субстрат, и флуоресценции, результатом деятельности PLC количественно и сравнении между областями мозга. Мы также обсудим наши оценки тормозящее действие некоторых лекарств на активность PLC, используя ту же систему. Хотя эта система, вероятно, пострадавших от других эндогенных флуоресценции соединений и/или абсорбция пробирного компонентов и тканей, измерения деятельности PLC, с помощью этой системы безопаснее и проще, чем, с помощью традиционных assay, который требует radiolabeled субстратов. Простые процедуры и манипуляции позволяют нам проанализировать деятельность PLC в мозги и других тканях медоносных пчел, участвующих в различных социальных задач.
Introduction
Европейская медоносной пчелы (Apis mellifera L.) является эусоциальных насекомых, и Женский пчел Показать каста зависимых воспроизводства и зависящих от возраста разделение труда. Например в стерильных касты пчел, упоминаемые как «рабочие», молодых людей кормить выводка, в то время как старые комбикорма нектара и пыльцы вне куст1. Обучение и память, что способность критически важную роль в жизни пчелы, потому что кормоуборочные комбайны должны постоянно идти вперед и назад между источниками продовольствия и их гнезда и затем общаться расположения источников хорошее питание для их nestmates через танец сообщение1. Предыдущие исследования показали, что MB, выше мозговой центр в насекомых, участвует в учить и память способности пчелы2,3,4. Дифференциально выраженной генов и белков были определены в различных регионах мозга пчелы5,6,,78,9,10 ,11, предполагая, что они связаны с уникальными функциями каждой области мозга. Хотя фармакологических ингибирования или активации белка интерес представляет собой хорошо использовать подход к раскрыть функцию белка в пчелы поведение12,13,14, это неизвестно ли все наркотики иметь функциональные последствия в различных регионах мозга медоносной пчелы. Проверка функций таких наркотиков будет укреплять выводы исследования поведенческой фармакологии.
Здесь мы сосредоточены на PLC, один из ферментов, причастных к мыши познания15,16,17,18. PLC кальция триггеры сигнализации от унижающего достоинство фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (пункт2) в инозитол 1,4,5-trisphosphate (IP-3) и диацилглицерол (ГПДР)19,,2021. IP3 открывает IP3 рецепторов в эндоплазматический ретикулум (ER), приводит к высвобождению ионов кальция от ER. Выпущенные кальция активирует кальция/Кальмодулин зависимая протеинкиназа II (CaMKII) с Кальмодулин и протеинкиназы C (PKC) в присутствии группы доступности базы данных. Обе протеинкиназы участвуют в процессе обучения и памяти22,23, в соответствии с привлечением PLC в этот процесс. ПЛК делятся на подтипы, включая PLCβ, PLCγ и PLCε, на основе их структуры20. Каждый подтип PLC активируется в другом контексте20, и генов, кодирующих эти подтипы дифференциально выражаются в различных тканях. Ранее мы показали, что пчелы MBs выражать гены, кодирующие PLCβ и PLCε подтипы на более высоких уровнях, чем остальные регионы мозга24, и что две пан PLC ингибиторы (edelfosine и неомицина сульфат [неомицин]) снижение активности PLC в различных регионах мозга и, действительно, влияют на обучение и память способность пчел24.
Традиционно Ферментативная активность PLC была измерена с помощью radiolabeled PIP225, который требует надлежащей подготовки, оборудования и средств. Недавно синтетических fluorogenic субстрат PLC был установленным26, что делает его легко оценить деятельность PLC в стандартных лаборатории. Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения деятельности PLC в различных мозга пчелы с использованием fluorogenic субстрата и впоследствии проверить тормозящее действие edelfosine и неомицина на PLC в этих тканях. Потому что протокол требует только основные манипуляции, могут быть применимы к исследования PLC активность в других тканях или областей мозга в пчел, выделенных для различных социальных задач.
Protocol
Representative Results
Discussion
Биохимические экспертиза деятельности белка крайне важно для понимания молекулярных сигналов в головном мозге, потому что активность фермента зависит от различных молекул, например субстратов и ингибиторов и может таким образом, изменить вместе с поведение животных (например, о?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Рисунок 4B – 4 D был изменен с Suenami и др. 24 с разрешения открытого биологии. Авторы выражают благодарность к издателю для разрешения. Эта работа была поддержана человека пограничной науки программы (RGY0077/2016) Шота Suenami и Ryo Миядзаки.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
Referências
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
