से मस्तिष्क Homogenate में Phospholipase सी गतिविधि का पता लगाने से मधुप
Summary
मधुप मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में phospholipase सी (पीएलसी) पर औषधीय एजेंटों के निरोधात्मक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हम उन क्षेत्रों में पीएलसी गतिविधि को मापने के लिए एक जैव रासायनिक परख उपस्थित । यह परख ऊतकों के बीच पीएलसी गतिविधि की तुलना के लिए उपयोगी हो सकता है, साथ ही साथ विभिंन व्यवहार प्रदर्शन मधुमक्खियों के बीच ।
Abstract
मधुप इस तरह के शिक्षण, स्मृति के रूप में जटिल व्यवहार और उच्च मस्तिष्क समारोह, मूल्यांकन के लिए एक मॉडल जीव है, और श्रम के विभाजन । मशरूम शरीर (एमबी) एक उच्च मस्तिष्क के लिए जटिल मधुप व्यवहार के तंत्रिका सब्सट्रेट होना प्रस्तावित केंद्र है । हालांकि पिछले अध्ययन जीन और प्रोटीन है कि अंतर एमबीएस और अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में व्यक्त कर रहे है की पहचान की, प्रत्येक क्षेत्र में प्रोटीन की गतिविधियों को अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । मस्तिष्क में इन प्रोटीन के कार्यों को प्रकट करने के लिए, औषधीय विश्लेषण एक व्यवहार्य दृष्टिकोण है, लेकिन यह पहली बार है कि औषधीय जोड़तोड़ वास्तव में इन मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रोटीन गतिविधि को बदलने की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है ।
हम पहले अंय मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में एमबीएस में phospholipase सी (पीएलसी) एंकोडिंग जीन की एक उच्च अभिव्यक्ति की पहचान की है, और औषधीय मधुप व्यवहार में पीएलसी की भागीदारी का आकलन किया । उस अध्ययन में, हम जैव रासायनिक दो औषधीय एजेंटों का परीक्षण किया और पुष्टि की कि वे एमबीएस और अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में पीएलसी गतिविधि में कमी आई । यहाँ, हम कैसे मधुप मस्तिष्क homogenate में पीएलसी गतिविधि का पता लगाने के लिए का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करते हैं । इस परख प्रणाली में, homogenates अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से व्युत्पंन एक सिंथेटिक fluorogenic सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं, और प्रतिदीप्ति पीएलसी गतिविधि से जिसके परिणामस्वरूप quantified है और मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच की तुलना में । हम भी एक ही प्रणाली का उपयोग पीएलसी गतिविधि पर कुछ दवाओं के निरोधात्मक प्रभाव के हमारे मूल्यांकन का वर्णन । हालांकि इस प्रणाली की संभावना अंय अंतर्जात प्रतिदीप्ति यौगिकों और/या परख घटकों और ऊतकों के अवशोषण से प्रभावित है, पीएलसी गतिविधि की माप इस प्रणाली का उपयोग करने से सुरक्षित और आसान है कि पारंपरिक परख का उपयोग कर, जो radiolabeled सब्सट्रेट की आवश्यकता है । सरल प्रक्रिया और जोड़तोड़ हमें दिमाग और विभिंन सामाजिक कार्यों में शामिल मधुमक्खियों के अंय ऊतकों में पीएलसी गतिविधि की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं ।
Introduction
यूरोपीय मधुप (एपीआई अफ्रिकन एल) एक eusocial कीट है, और महिला मधुमक्खियों दिखाने जाति पर निर्भर प्रजनन और श्रम के आयु पर निर्भर विभाजन । उदाहरण के लिए, मधुमक्खियों के बाँझ जाति में ‘ कार्यकर्ता ‘ के रूप में जाना जाता है, युवा व्यक्तियों चिंता फ़ीड जबकि पुराने लोगों को छत्ता1के बाहर अमृत और पराग चारा । सीखने और स्मृति की क्षमता मधुप के जीवन में गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि चारा विज्ञानियों को फिर से खाना स्रोतों और उनके घोंसले के बीच आगे पीछे जाना चाहिए और फिर नृत्य के माध्यम से अपने nestmates को अच्छा भोजन स्रोतों के स्थानों संवाद संचार1. पिछले अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि एमबी, कीड़ों में एक उच्च मस्तिष्क केंद्र, सीखने और मधुप2,3,4की स्मृति क्षमता में शामिल है । विभेदक व्यक्त जीन और प्रोटीन के विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में की पहचान की गई है मधुप5,6,7,8,9,10 ,11, सुझाव है कि वे प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के अद्वितीय कार्यों से संबंधित हैं । हालांकि औषधीय अवरोध या ब्याज की एक प्रोटीन के सक्रियकरण एक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है मधुप व्यवहार12,13,14में प्रोटीन के समारोह प्रकट, यह अज्ञात है कि क्या सभी दवाओं मधुप मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में कार्यात्मक प्रभाव है । ऐसी दवाओं के कार्यों का सत्यापन व्यवहार औषध विज्ञान के अध्ययन में निष्कर्ष को मजबूत करेगा.
यहां, हम पीएलसी, माउस अनुभूति15,16,17,18में फंसा एंजाइमों में से एक पर ध्यान केंद्रित । पीएलसी phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (रंज2) में inositol 1, 4, 5-trisphosphate (आईपी3) और diacylglycerol (तमंचा)19,20,21के द्वारा कैल्शियम संकेतन ट्रिगर । आईपी3 endoplasmic जालिका पर आईपी3 रिसेप्टर्स खोलता है (एर), एर से कैल्शियम आयनों की रिहाई के लिए अग्रणी. स्पर्म कैल्शियम दोनों कैल्शियम/calmodulin-निर्भर प्रोटीन कळेनासे II (CaMKII) को calmodulin और प्रोटीन कळेनासे सी (PKC) के साथ तमंचा की मौजूदगी में सक्रिय करता है । दोनों प्रोटीन kinases इस प्रक्रिया में पीएलसी की भागीदारी के साथ लगातार22,23, सीखने और स्मृति में शामिल हैं । PLCs PLCβ, PLCγ, और PLCε, उनके20संरचनाओं के आधार पर सहित उपप्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं । प्रत्येक पीएलसी उपप्रकार एक अलग संदर्भ20में सक्रिय है, और उन उपप्रकार एंकोडिंग जीन अंतर अलग ऊतकों में व्यक्त कर रहे हैं । हम पहले से प्रदर्शन किया है कि मधुप एमबीएस एक्सप्रेस जीन शेष मस्तिष्क क्षेत्रों से उच्च स्तर पर PLCβ और PLCε उपप्रकार एंकोडिंग24, और है कि दो पैन-पीएलसी अवरोधकों (edelfosine और निओमायसिन सल्फेट [निओमायसिन]) में कमी पीएलसी गतिविधि विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों और, वास्तव में, सीखने और मधुप24की स्मृति क्षमता को प्रभावित ।
परंपरागत रूप से, पीएलसी के एंजाइमी गतिविधि radiolabeled रंज225का उपयोग कर मापा गया है, जो उचित प्रशिक्षण, उपकरण, और सुविधाओं की आवश्यकता है । हाल ही में, पीएलसी की एक सिंथेटिक fluorogenic सब्सट्रेट26स्थापित किया गया है, यह आसान मानक प्रयोगशाला में पीएलसी गतिविधि का आकलन करने के लिए बना रही है । यहाँ, हम fluorogenic सब्सट्रेट का उपयोग कर मधुप के विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में पीएलसी गतिविधि का पता लगाने और बाद में इन ऊतकों में पीएलसी पर edelfosine और निओमायसिन के निरोधात्मक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । क्योंकि प्रोटोकॉल केवल बुनियादी जोड़तोड़ की आवश्यकता है, यह अन्य ऊतकों या विभिन्न सामाजिक कार्यों के लिए आवंटित मधुमक्खियों में मस्तिष्क क्षेत्रों में पीएलसी गतिविधि के अध्ययन के लिए लागू हो सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन गतिविधि की जैव रासायनिक परीक्षा, मस्तिष्क में आणविक संकेतन को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक एंजाइम की गतिविधि विभिन्न अणुओं द्वारा प्रभावित होता है, जैसे कि सब्सट्रेट और अवरोधक?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चित्रा 4B – 4d Suenami एट अल से संशोधित किया गया था । 24 जीव विज्ञान की अनुमति के साथ खुला । लेखक अनुमति के लिए प्रकाशक के आभारी हैं । इस कार्य को मानव फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम (RGY0077/2016) से शोता Suenami और रयो मियाज़ाकी के सहयोग से किया गया ।
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
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