Påvisning af fosfolipase C aktivitet i hjernen homogenatet fra honningbien
Summary
For at teste de hæmmende virkninger af farmakologiske stoffer på fosfolipase C (PLC) i forskellige regioner af hjernen, honningbien, præsenterer vi en biokemisk analyse for at måle PLC aktivitet i disse regioner. Denne analyse kan være nyttigt for sammenligne PLC aktivitet blandt væv, og blandt bier udstiller forskellige funktionsmåder.
Abstract
Honningbien er en model organisme til evaluering af komplekse adfærd og højere hjernefunktion, såsom indlæring, hukommelse og arbejdsdeling. Champignon kroppen (MB) er en højere hjernen center foreslået at være neurale underlaget af komplekse honningbien adfærd. Selv om tidligere undersøgelser identificeret gener og proteiner, der angives varierende i MBs og andre områder af hjernen, er aktiviteter af proteiner i hver region endnu ikke fuldt forstået. For at afsløre funktionerne af disse proteiner i hjernen, farmakologiske analyse er en realistisk tilgang, men det er nødvendigt først at bekræfte, at farmakologiske manipulationer faktisk ændre protein aktivitet i disse områder af hjernen.
Vi tidligere identificerede et højere udtryk af gener kodning fosfolipase C (PLC) i MBs end i andre områder af hjernen, og vurderet farmakologisk inddragelse af PLC i honningbien adfærd. I denne undersøgelse, vi biokemisk testet to farmakologiske agenter og bekræftet, at de faldt PLC aktivitet i MBs og andre områder af hjernen. Vi præsenterer her, en detaljeret beskrivelse af hvordan man kan opdage PLC aktivitet i honningbien hjernen homogenatet. I denne analyse system, homogeniseret stammer fra forskellige hjerneregioner er reageret med et syntetisk fluorogenic substrat, og fluorescens som følge af PLC aktivitet er kvantificeret og sammenlignet mellem hjerneregioner. Vi har også beskrive vores vurdering af de hæmmende virkninger af visse stoffer på PLC aktivitet ved hjælp af det samme system. Selv om dette system er sandsynligvis påvirket af andre endogene fluorescens forbindelser og/eller absorptionen af assay komponenter og væv, måling af PLC aktivitet ved hjælp af dette system er sikrere og lettere end at bruge den traditionelle analyse, som kræver radiolabeled substrater. Enkel procedure og manipulationer tillade os at undersøge PLC aktivitet i hjernen og andre væv af honningbier involveret i forskellige sociale opgaver.
Introduction
Den europæiske honningbi (Apis mellifera L.) er en eusocial insekt, og kvindelige bier Vis kaste-afhængige reproduktion og alder afhængige arbejdsdeling. For eksempel, i den sterile kaste af bier omtales som «arbejdstagere», feed yngre individer yngel mens ældre fouragere nektar og pollen udenfor hive1. Indlæring og hukommelse evne er kritisk vigtigt i livet af honningbi, fordi foragers skal gentagne gange går frem og tilbage mellem fødekilder og deres rede og derefter kommunikere placeringen af gode mad kilder til deres nestmates gennem dans meddelelse1. Tidligere undersøgelser viste, at MB, en højere hjernen center i insekter, er involveret i indlæring og hukommelse evne til honningbien2,3,4. Varierende udtrykte gener og proteiner er blevet identificeret i forskellige områder af hjernen af honningbi5,6,7,8,9,10 ,11, tyder på, at de er relateret til de unikke funktioner i hvert område af hjernen. Selv om farmakologisk hæmning eller aktivering af et protein af interesse er en godt brugt tilgang til at afsløre funktionen af protein i honningbien adfærd12,13,14, er det uvist, om alle narkotika har funktionelle virkninger i forskellige regioner af hjernen, honningbien. Validering af funktioner af sådanne lægemidler vil styrke konklusioner i undersøgelser af adfærdsmæssige farmakologi.
Her fokuserer vi på PLC, en af de enzymer, der er impliceret i mus kognition15,16,17,18. PLC udløser calcium signalering af nedværdigende phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) til inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 åbner IP3 receptorer på det endoplasmatiske reticulum (ER), fører til frigivelse af calciumioner fra Skadestuen. Den frigivne calcium aktiverer både calcium/calmodulin-afhængige protein kinase II (CaMKII) med calmodulin og protein kinase C (PKC) i DAG. Begge protein kinaser er involveret i indlæring og hukommelse22,23, overensstemmelse med PLC inddrages i denne proces. PLC’er er kategoriseret i undertyper, herunder PLCβ, PLCγ og PLCε, baseret på deres strukturer20. Hver PLC subtype er aktiveret i en anden sammenhæng20, og gener kodning disse undertyper angives varierende i forskellige væv. Vi tidligere har vist, at honningbien MBs express gener kodning PLCβ og PLCε undertyper på højere niveauer end de resterende hjerne regioner24, og at to pan-PLC hæmmere (edelfosine og neomycin sulfat [neomycin]) fald PLC aktivitet i forskellige hjernen regioner og faktisk påvirke indlæring og hukommelse evne til honningbien24.
Traditionelt, er den enzymatiske aktivitet af PLC blevet målt ved hjælp af radiolabeled PIP225, der kræver passende uddannelse, udstyr og faciliteter. For nylig, et syntetisk fluorogenic substrat af PLC har været etableret26, hvilket gør det nemt at vurdere PLC aktivitet i standard laboratoriet. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol til at registrere PLC aktivitet i forskellige hjerneregioner af honningbien ved hjælp af fluorogenic substrat og efterfølgende afprøve de hæmmende virkninger af edelfosine og neomycin på PLC i disse væv. Da protokollen kræver kun grundlæggende manipulationer, kan det anvendes til undersøgelser af PLC aktivitet i andre væv eller områder i hjernen i bier tildeles forskellige sociale opgaver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den biokemiske undersøgelse af protein aktivitet er dybt vigtigt for forståelsen af molekylære signalering i hjernen, fordi aktiviteten af et enzym, der påvirkes af forskellige molekyler, som substrater og hæmmere, og kan således ændre langs med dyrs adfærd (f.eks., indlæring og hukommelse)5. I honningbien undersøgelser, er enzymer som cyklisk AMP-afhængige protein kinase A, cyklisk GMP-afhængige protein kinase, PKC, fosforyleres CaMKII og adenylate cyclase rapporteret angives…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figur 4B – 4 D blev ændret fra Suenami et al. 24 med tilladelsen af biologi Open. Forfatterne er taknemmelig for, at udgiveren for tilladelsen. Dette arbejde blev støttet af Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) til Shota Suenami og Ryo Miyazaki.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
Referências
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
