Deteksjon av fosfolipase C aktivitet i hjernen Homogenate fra Honeybee
Summary
For å teste hemmende effekten av farmakologisk agenter på fosfolipase C (PLC) i ulike regioner av honeybee hjernen, presenterer vi en biokjemiske analysen for å måle PLC aktivitet i disse regionene. Denne analysen kan være nyttige for sammenligning PLC aktivitet blant vev, og bier viser forskjellige virkemåter.
Abstract
Honeybee er en modell organisme for å vurdere komplekse atferd og høyere hjernefunksjon, for eksempel læring og hukommelse arbeidsdeling. Sopp kroppen (MB) er en høyere hjernen center foreslått å være nevrale underlaget komplekse honeybee atferd. Selv om tidligere studier identifisert gener og proteiner som er ulikt uttrykt i MBs og andre områder av hjernen, er aktiviteter proteinene i hver region ennå ikke fullt ut forstått. For å vise funksjonene av disse proteinene i hjernen, pharmacologic analyse er en mulig tilnærming, men det er først nødvendig for å bekrefte at pharmacologic manipulasjoner faktisk endre protein aktiviteten i disse områder av hjernen.
Vi tidligere identifisert en høyere uttrykket av gener som koder fosfolipase C (PLC) i MBs enn i andre områder av hjernen og vurdert farmakologisk involvering av PLC i honeybee atferd. I denne studien, vi biokjemisk testet to pharmacologic agenter og bekreftet at de redusert PLC aktivitet i MBs og andre områder av hjernen. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av hvordan oppdage PLC aktivitet i honeybee hjernen homogenate. I denne analysen system, homogenates avledet fra forskjellige hjernen regioner er reagerte med en syntetisk fluorogenic substrat og fluorescens skyldes PLC aktivitet er kvantifisert og forhold mellom områder av hjernen. Også beskriver vi våre evaluering av hemmende effekten av visse legemidler PLC aktivitet bruker samme system. Selv om dette systemet er sannsynligvis påvirket av andre endogene fluorescens forbindelser og/eller absorbansen analysen komponentene og vev, måling av PLC aktivitet med dette systemet er tryggere og enklere enn det benytter tradisjonelle analysen, som krever radiolabeled underlag. Enkel prosedyre og manipulasjoner tillate oss å undersøke PLC aktivitet i hjernen og andre vev av honeybees involvert i ulike sosiale aktiviteter.
Introduction
Europeiske honeybee (APIene mellifera L.) er et eusocial insekt kvinnelige bier Vis caste-avhengige reproduksjon og alder-avhengige arbeidsdeling. For eksempel i sterilt kastesystemet av bier referert til som “arbeidere”, mate yngre enkeltpersoner de han funderer mens eldre grovfôr nektar og pollen utenfor strukturen1. Læring og hukommelse evne er kritisk viktig i livet til honeybee, fordi sankere må gjentatte ganger går frem og tilbake mellom mat kilder og deres reir og deretter kommunisere plasseringen av god mat kilder til deres nestmates gjennom dans kommunikasjon1. Tidligere studier har vist at MB, en høyere hjernen sentrum i insekter, er involvert i læring og hukommelse evne til honeybee2,3,4. Ulikt uttrykt gener og proteiner er blitt identifisert i ulike områder av hjernen av honeybee5,6,7,8,9,10 ,11, noe som tyder på at de er knyttet til unike funksjoner av hver hjernen regionen. Men farmakologisk hemming eller aktivering av et protein av interesse er en godt brukt tilnærming til avsløre funksjonen av protein i honeybee atferd12,13,14, er det ukjent om alle medisiner har funksjonelle effekter i ulike områder av honeybee hjernen. Validering av funksjonene til slike legemidler vil styrke konklusjonene i studier av atferdsmessige farmakologi.
Her fokusere vi på PLC, en av enzymer innblandet i musen kognisjon15,16,17,18. PLC utløser kalsium signalering av nedverdigende phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) inn inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 åpner IP3 reseptorer på det endoplasmatiske retikulum (ER), fører til utgivelsen av kalsiumioner fra ER. Utgitt kalsium aktiverer både kalsium/calmodulin-avhengige protein kinase II (CaMKII) med calmodulin og protein kinase C (PKC) i nærvær av DAG. Begge protein kinaser er involvert i læring og hukommelse22,23, konsekvent med involvering av PLC i denne prosessen. Foretak kategoriseres subtyper, inkludert PLCβ, PLCγ og PLCε, basert på deres strukturer20. Hver PLC undertype aktiveres i en annen sammenheng20, og gener som koder de subtyper uttrykkes ulikt i forskjellige vev. Vi viste tidligere at honeybee MBs express gener som koder PLCβ og PLCε subtyper på høyere nivå enn de resterende hjerne regioner24og at to pan-PLC hemmere (edelfosine og neomycin sulfate [neomycin]) redusere PLC aktivitet i forskjellige hjernen regioner og, faktisk, påvirke læring og hukommelse evne til honeybee24.
Tradisjonelt har den enzymatiske aktiviteten PLC blitt målt med radiolabeled PIP225, som krever hensiktsmessig opplæring, utstyr og fasiliteter. Nylig, et syntetisk fluorogenic substrat plc har vært etablert26, gjør det enkelt å vurdere PLC aktivitet i standard laboratoriet. Her presenterer vi en detaljert protokoll å oppdage PLC aktivitet i forskjellige hjernen regioner i honeybee bruker fluorogenic underlaget og deretter teste hemmende effekten av edelfosine og neomycin på PLC i disse vev. Fordi protokollen krever bare grunnleggende manipulasjoner, kan det være aktuelt å studier av PLC aktivitet i andre vev eller hjernen områder i bier tildelt forskjellige sosiale aktiviteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biokjemiske undersøkelse av protein aktivitet er svært viktig for å forstå molekylær signalering i hjernen, fordi aktiviteten til et enzym påvirkes av ulike molekyler, som underlag og hemmere, og kan dermed endre sammen med dyr atferd (f.eks, læring og hukommelse)5. I honeybee studier, er enzymer som syklisk AMP-avhengige protein kinase A, syklisk GMP-avhengige protein kinase, PKC, fosforylert CaMKII og adenylate cyclase rapportert å være ulikt uttrykt i ulike områder av hjernen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figur 4B – 4 D ble endret fra Suenami et al. 24 med tillatelse fra biologi åpen. Forfatterne er takknemlig til utgiveren for tillatelse. Dette arbeidet ble støttet av den menneskelige Frontier Science Program (RGY0077/2016) Shota Suenami og Ryo Miyazaki.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
Referências
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
