Påvisande av fosfolipas C aktivitet i hjärnan Homogenatet från honungsbiet
Summary
För att testa de hämmande effekterna av farmakologiska agenter på fosfolipas C (PLC) i olika regioner av honungsbinas hjärnan, presenterar vi en biokemisk analys för att mäta PLC verksamhet i dessa regioner. Denna analys kan vara användbara för att jämföra PLC aktivitet hos vävnader, liksom hos bina uppvisar olika beteenden.
Abstract
Honungsbiet är en modellorganism för utvärdering av komplexa beteenden och högre hjärnfunktion, såsom lärande, minne och arbetsfördelning. Svamp kroppen (MB) är ett högre hjärnans centrum föreslås bli neurala underlaget av komplexa honungsbinas beteenden. Även om tidigare studier identifierat gener och proteiner som uttrycks differentially i MBs och andra regioner i hjärnan, är verksamhet av proteiner i varje region ännu inte helt förstått. För att avslöja funktionerna av dessa proteiner i hjärnan, farmakologiska analys är en genomförbar strategi, men det är först nödvändigt att bekräfta att farmakologiska manipulationer verkligen förändra proteinaktiviteten i dessa regioner av hjärnan.
Vi tidigare identifierat ett högre uttryck av gener som kodar fosfolipas C (PLC) i MBSNA än i andra regioner av hjärnan och bedömas farmakologiskt PLC engagemang i honungsbinas beteende. I den studien vi biokemiskt testat två farmakologiska agenter och bekräftade att de minskade PLC aktivitet i MBs och andra regioner i hjärnan. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av hur man upptäcker PLC aktivitet i Honungsbinas hjärna Homogenatet. I detta test system, homogenates härrör från olika hjärnregioner är reagerade med ett syntetiskt fluorogenic substrat och fluorescens följd PLC aktivitet är kvantifierade och jämfört mellan regioner i hjärnan. Vi beskriver också våra utvärdering av de hämmande effekterna av vissa läkemedel på PLC aktivitet använder samma system. Även om detta system sannolikt påverkas av andra endogena fluorescens föreningar eller absorbansen assay komponenter och vävnader, mätning av PLC aktivitet med detta system är säkrare och enklare än att använda traditionella analysen, som kräver radiomärkt substrat. Det enkla förfarandet och manipulationer tillåter oss att undersöka PLC aktivitet i hjärnan och andra vävnader av honungsbin inblandade i olika sociala aktiviteter.
Introduction
Europeiska honungsbiet (Apis mellifera L.) är en eusociala insekter och kvinnliga bin Visa kast-beroende reproduktion och åldersberoende arbetsfördelning. Till exempel i sterila kasten av bin som kallas ‘arbetare’, föda yngre individer barnaskaror medan äldre födosöker nektar och pollen utanför kupan1. Inlärning och minne förmåga är kritiskt viktigt i livet av honungsbiet, eftersom halvöknar måste upprepade gånger gå fram och tillbaka mellan födokällor och boet och sedan kommunicera platserna för bra matkällor till deras nestmates genom Dans meddelande1. Tidigare studier har visat att MB, en högre hjärnan center i insekter, är inblandade i inlärning och minne förmåga av honungsbinas2,3,4. Differentiellt uttryckta gener och proteiner identifierats i olika hjärnregioner av honungsbinas5,6,7,8,9,10 ,11, vilket tyder på att de är relaterade till de unika funktionerna i varje hjärna region. Men farmakologisk hämning eller aktivering av ett protein av intresse är ett väl använt tillvägagångssätt att avslöja funktionen av proteinet i honungsbinas beteende12,13,14, är det okänt huruvida alla droger har funktionella effekter i olika regioner av honungsbinas hjärnan. Validering av fungerar av sådana droger stärker slutsatserna i studierna av beteendemässiga farmakologi.
Här fokuserar vi på PLC, en av de enzymer som är inblandade i mus kognition15,16,17,18. PLC utlöser calcium signalering av förnedrande fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) till inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3) och diglyceridolja (DAG)19,20,21. IP3 öppnar IP3 receptorer på endoplasmatiska retiklet (ER), leder till utsläpp av kalciumjoner från ER. Släppta kalcium aktiverar både kalcium/calmodulin-beroende proteinkinas II (Chytridiomycota) med calmodulin och proteinkinas C (PKC) i närvaro av DAG. Båda proteinkinaser är inblandade i inlärning och minne22,23, konsekvent med PLC deltagande i denna process. Aktiebolagen kategoriseras in i subtyper, inklusive PLCβ, PLCγ och PLCε, baserat på deras strukturer20. Varje PLC undertyp aktiveras i ett annat sammanhang20, och gener som kodar för dessa subtyper är Differentiellt uttryckta i olika vävnader. Vi har tidigare visat att honungsbinas MBs express gener som kodar för PLCβ och PLCε undertyper på högre nivåer än de återstående hjärna regioner24och att två pan-PLC-hämmare (edelfosine och neomycin sulfat [neomycin]) minska PLC aktiviteten i olika regioner av hjärnan och, faktiskt påverkar inlärning och minne på honungsbinas24.
Traditionellt, har den enzymatiska aktiviteten av PLC mätts med hjälp av radioaktivt märkt PIP225, vilket kräver lämplig utbildning, utrustning och faciliteter. Syntetiska fluorogenic substrat till PLC har nyligen varit etablerade26, vilket gör det enkelt att bedöma PLC aktivitet i standard laboratorium. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll att upptäcka PLC aktivitet i olika hjärnregioner av honungsbiet använder fluorogenic substratet och därefter testa de hämmande effekterna av edelfosine och neomycin på PLC i dessa vävnader. Eftersom protokollet kräver endast grundläggande manipulationer, kan det gälla studier av PLC aktivitet i andra vävnader eller hjärnområden i bina fördelas till olika sociala aktiviteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biokemisk undersökning av proteinaktiviteten är djupt viktigt för att förstå molekylär signalering i hjärnan, eftersom aktiviteten hos ett enzym påverkas av olika molekyler, som substrat och hämmare, och kan således ändra längs med djurs beteende (t.ex., inlärning och minne)5. I honungsbinas studier redovisas enzymer såsom cykliskt AMP-beroende proteinkinas A, cykliskt GMP-beroende proteinkinas, PKC, fosforylerade Chytridiomycota och adenylatcyklas differentially uttrycks i …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figur 4B – 4 D ändrades från Suenami et al. 24 med tillstånd av biologi öppen. Författarna är tacksam till förlaget för behörigheten. Detta arbete stöds av Human Frontier Science programmet (RGY0077/2016) att Shota Suenami och Ryo Miyazaki.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
Referências
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
