酿酒酵母间歇培养中的指数生长动力学分析呼吸和发酵代谢
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以估计的呼吸和发酵代谢通过适当的指数增长的酿酒酵母的指数增长方程。动力学参数的计算允许筛选物质/化合物对发酵或线粒体呼吸的影响。
Abstract
酵母细胞在指数阶段通过发酵和/或线粒体呼吸产生 ATP 来维持其生长。发酵碳浓度主要控制酵母细胞如何产生 ATP;因此, 发酵碳水化合物水平的变化推动了酵母的能量代谢。本文介绍了一种基于指数酵母生长的高通量方法, 以估计浓度变化和碳源性质对呼吸和发酵代谢的影响。通过测定 600 nm 的光密度 (OD), 在微板块或摇动的锥形烧瓶中测定酵母的生长。然后用绘制 OD 与时间的方法建立生长曲线, 允许指数相的识别和选择, 并配以指数增长方程获得动力学参数。低特异增长率以加倍倍的速度通常代表呼吸增长。反之, 更高的特定增长率以低倍倍的速度表明发酵生长。利用已知的呼吸或发酵条件, 如非发酵碳源或较高浓度的发酵糖, 估计加倍时间和特定生长速率的阈值。这是为每个特定的应变得到。最后, 将所计算的动力学参数与阈值进行比较, 确定酵母是否显示发酵和/或呼吸生长。这种方法的优点是它相对简单, 了解物质/化合物对发酵或呼吸代谢的影响。重要的是要强调, 增长是一个复杂和复杂的生物过程;因此, 该方法的初步数据必须通过定量的氧消耗和发酵副产物的积累来证实。因此, 这种技术可以作为初步筛选的化合物/物质, 可能扰乱或提高发酵或呼吸代谢。
Introduction
酿酒酵母的生长已成为识别许多生理和分子机制的宝贵工具。增长主要用三种方法来衡量: 现场测试的串行稀释、集落单元计数和生长曲线。这些技术可以单独使用或结合各种基质、环境条件、突变体和化学物质来调查特定的反应或表型。
线粒体呼吸是一个生物过程中, 生长动力学已成功地应用于发现未知机制。在这种情况下, 补充的增长媒体与非可发酵的碳源, 如甘油, 乳酸, 或乙醇 (这是完全代谢的线粒体呼吸), 作为唯一的碳和能源的来源, 可以评估呼吸生长是检测氧化磷酸化活性1的扰动的重要因素。另一方面, 用生长动力学模型来破译发酵后的机理是很复杂的。
对发酵和线粒体呼吸的研究对于阐明某些表型的分子机制, 如 Crabtree 和华宝效应2,3至关重要。Crabtree 效应的特点是酵通量增加, 线粒体呼吸抑制, 并建立发酵为主要途径生成 ATP 的存在高浓度的可发酵碳水化合物 (>0.8 毫米)4,5。华宝效应是代谢模拟到 Crabtree 效应, 不同的是, 在哺乳动物细胞, 发酵的主要产品是乳酸6。的确, 华宝效应是由多种癌细胞所表现出来的, 即使在氧气7的情况下, 也会引发葡萄糖的摄取和消耗。因此, 研究从呼吸到发酵的 Crabtree 效应的分子基础, 既有生物技术的影响 (乙醇的生产), 也有潜在的癌症研究的影响。
酵母的生长可能是研究 Crabtree 和华宝效应的合适工具。这个想法基于的事实是, 在酵母指数阶段, 用于生产 ATP 的中心途径是线粒体呼吸和发酵, 这是维持生长必不可少的。例如,酵母的生长与 ATP 生成通路的功能密切相关。在美国酿酒酵母中,线粒体呼吸产生的每葡萄糖分子大约有18个 atp 分子, 而发酵只产生2个 atp 分子, 因此预计生长速率与代谢通路有紧密的联系。生产 ATP8。在这方面, 当发酵是生成 atp 的主要途径时, 酵母通过提高葡萄糖摄取率来补偿低 atp 的产量。相反, 使用线粒体呼吸作为主要 ATP 来源的酵母细胞的葡萄糖消耗量是低的。这表明, 在确定 ATP 的生成方式之前, 酵母对碳水化合物的可用性有很重要的意义。因此, 葡萄糖的有效性在酵母发酵和线粒体呼吸之间的转换中起着重要的作用.在大量葡萄糖的存在下, 酵母更倾向于发酵作为生成 ATP 的中心途径。有趣的是, 当酵母发酵时, 特定的生长速率保持在最大值。另一方面, 在低血糖水平下,酵母通过线粒体呼吸产生 ATP, 维持较低的生长速率。因此, 葡萄糖浓度的变化和其他碳源的使用导致酵母在发酵和呼吸生长之间的偏好发生变化。考虑到这一事实的指数增长方程, 可以获得的生物意义的动力学参数, 如加倍时间 (Dt) 和特定增长率 (µ)。例如, 当酵母使用线粒体呼吸作为主要途径时, 发现了较低的µ值。相反, 在有利于发酵的条件下, 发现了较高的µ值。这种方法可用于测量任何影响酵母发酵和线粒体呼吸的化学物质的可能机制.
本文的目的是提出一种基于生长动力学的方法来筛选特定物质/化合物对线粒体呼吸或发酵的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
自从 j. Monod10表示, 对细菌培养的研究是微生物学的基本方法, 已经过去了很长一段时间。分子工具的出现延缓了生长作为一种技术的使用和研究。尽管增长的复杂性涉及许多相互关联的过程, 但它的基本机制可以用数学模型11来描述。这是一个健壮的方法, 可作为一个补充工具, 以阐明最复杂的分子机制12。
要获得此方法的?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这一项目得到了委员会 Ciencia y Tecnología (赠款号 293940) 和基金会 TELMEX-TELCEL (赠款号 162005585) 的赠款的支助, 两者都是 IKOM。
Materials
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
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