JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Published: November 07, 2018
doi:
10.3791/58200
, , , ,
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection,Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Salmonella spp. /Shigella spp. ortak patojenler için ishal atfedilen. Burada, biz yüksek üretilen iş platformu Salmonella spp. testi ile taranması için tarif / gerçek zamanlı PCR kullanarakShigella spp. rehberli kültürü ile kombine.

Abstract

Akut gastroenterit fekal-oral iletim zaman zaman, özellikle gıda ve su ele insanlar Salmonella spp./Shigella spp. tarafından enfekte oluşur Salmonella spp./Shigella spp. tespiti için altın standart yöntem doğrudan kültür ama bu emek yoğun ve zaman alıcı. Burada, tarama, gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) destekli kültürü ile kombine kullanarak Salmonella spp./Shigella spp. için bir yüksek-den geçerek platform açıklayın. İki büyük aşama vardır: gerçek zamanlı PCR ve Rehberli kültür. İlk aşama (gerçek zamanlı PCR), biz her adım yöntemi açıklamak: örnek toplama, ön zenginleştirme, DNA ekstraksiyon ve gerçek zamanlı PCR. Gerçek zamanlı PCR sonucu olumlu ise, o zaman ikinci aşama (Rehberli kültür) gerçekleştirilir: seçici kültür, biyokimyasal tanımı ve serolojik karakterizasyonu. Biz de bundan oluşturulan temsilcisi sonuçları göstermektedir. Burada açıklanan protokol Salmonella spp. hızlı, belirli, hassas ve yüksek işlem hacmi ile taranması için değerli bir platform olur /Shigella spp.

Introduction

İshal hala yaygın bir sağlık sorunu ile yüksek görülme oranı genel olarak1,2olduğunu. Ölüm oranı nispeten düşük olsa da, bazı hastalarda hafta (örneğin, gevşek ve sulu dışkılama, tuvalete gitmek için bir aciliyet), çeşitli belirtileri göstermek hangi sosyo-ekonomik etkisi çok yüksek3,4yapmak. Daha ciddi, bazı hastalar bile irritabl barsak sendromu tedavi edilmezse5yaptı geliştirmek. Bakteri, virüs ve parazitler ishal6neden olabilir çeşitli türleri vardır. Salmonella spp. /Shigella spp. Akut gastroenterit7,8,9,10,11iletimi için en yaygın bakteriler arasında yer alıyor. Bu nedenle, birçok ilinden yasalar veya yönetmelikler düzenli Salmonella spp. için verilen /Shigella spp. eleme yiyecek ve su ele alabileceğinizi insanlar arasında. Örneğin, Çin hükümeti yasalar zorunlu Salmonella spp. için yayınladık /Shigella spp. eleme yılda bir kez.

Salmonella spp. için altın standart yöntem /Shigella spp. algılama bakteri kültürü. Bakteri kültürü ve art arda gelen biyokimyasal kimlik ve serolojik karakterizasyonu, bakteriler, hastalık salgını yönetimi ve antimikrobiyal hastaların tedavisi yardım için profil oluşturma kolaylaştırabilir tür belirlemek için 12. aynı zamanda Salmonella spp. sırasında enfeksiyon kaynağı iz yardımcı /Shigella spp. salgını13. Ancak, bu yöntem emek yoğun (gerektiren el ile işlem) ve zaman alıcı (birkaç gün) daha az çekici, özellikle örnekleri7çok sayıda test etmek içindir. Ayrıca, culturable (VBNC) Salmonella spp. ama /Shigella spp.14bazı dışkı örnekleri var olabilir. İçinde görüş-in bu sakıncaları,-si olmak güvenilir birçok laboratuar Salmonella spp. algılanması için yeni teknikler geliştirmek /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. aralarında polimeraz zincir tepkimesi (PCR) en yaygın olan nükleer asit amplifikasyon testi (NAAT), tüm bu yöntemleri kullanın. Bir büyük NAAT dayalı yöntemlerin ölü bakteriler, hatta bakteriyel enkaz içeren eksik genomik DNA, olumlu sonuçlar26doğru tanı hastalığın büyük ölçüde etkileyebilir, gösterebilirim kısıtlamasıdır. Blanco ve ark. Bu moleküler tahlil son derece hassas, sadece uygun Salmonella kültürlerde, aynı zamanda kısmi genleri ve son enfeksiyonlar ya da kirlenme26ölü ya da kamunun bakteri olduğunu gösterdi. Bu nedenle, yeni teknoloji geliştirilmelidir.

Burada, birleştirir NAAT yönteme ve kültür göre bir roman yöntemi açıklanmıştır. Şekil 1‘ de gösterildiği gibi bu yeni yöntem gerçek zamanlı PCR ilk eleme uygular ve sonra olumlu örnekler bakteri kültür ve kimlik için gönderilir.

Protocol

Protokol Zhuhai Uluslararası seyahat sağlık merkezi insan Araştırma Etik Komitesi tarafından kuralları izler. Lütfen deneme sırasında standart steril işlemini kullanın. 1. Kültür medya kompozisyon ve hazırlık Besin et suyu hazırlayın: Erimesi %1 pepton, % 0.3 sığır eti özü, % 0.5 sodyum klorür, % 0,1 glikoz H2O, pH 7.5 ve basınçlı kap ayarlamak 121 ° C 15 dakika içinde. Selenit sistin orta hazırlamak: % 0.5 pepton, %0,4 laktoz, % 1’n…

Representative Results

Salmonella spp. tarama için uygulanan protokol /Shigella spp. anal dışkıda örnekleri yiyecek ve su ele alabileceğinizi kişilerden. Gerçek zamanlı PCR adımda, Şekil 5’A, gösterildiği gibi vardı karışık örnek Salmonella spp. için pozitif olduğu anlamına geliyordu HEX kanaldaki başarılı bir amplifikasyon Sonra bir daha da gerçek zaman…

Discussion

Salmonella spp. beri /Shigella spp. kez gıda zehirlenmesi ve fekal-oral iletim Akut gastroenterit28,29 ile ilişkili ve emek yoğun veya zaman alıcı rutin yöntemdir 7, biz yüksek üretilen iş platformu Salmonella spp. için tarif /Shigella spp. tarama, gerçek zamanlı PCR kullanarak rehberli kültürü ile kombine.

Dikkate bu platform kapasitesini en üst düzeye çıka…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser bilim ve teknoloji programı Zhuhai, Çin (grant sayı 20171009E030064), bilim ve teknoloji programı Guangdong, Çin (grant sayı 2015A020211004) ve bilim ve teknoloji programı genel yönetim tarafından desteklenmiştir Kalite gözetim, denetim ve karantina (grant numara 2016IK302, 2017IK224) Çin Halk Cumhuriyeti in.

Materials

Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact–United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana–salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water – United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

SalmonellaShigellaHigh-throughput ScreeningNAATReal-time PCRCulture IdentificationPathogensVibrioStaphylococcusE. ColiPre-enrichmentCentrifugationDNA ExtractionReal-time PCRSelenite Crystal MediumColony SelectionAutomated Microbial IdentificationO-antigen CharacterizationH-antigen Characterization
check_url/pt/58200?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Yang, Z., Chen, X., Tu, C., Su, Y., Wang, H. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image