Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Anna M. Chiarella; Tiffany A. Wang; Kyle V. Butler; Jian Jin; Nathaniel A. Hathaway

doi:10.3791/58222

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Artigo de método

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

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DOI:

10.3791/58222

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20 de setembro de 2018

Anna M. Chiarella¹ , Tiffany A. Wang² , Kyle V. Butler³ , Jian Jin³ , Nathaniel A. Hathaway⁴

¹Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, ²College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, ³Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ⁴Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Neste artigo

Resumo

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Resumo

Regulamento de compactação da cromatina é um processo importante que regula a expressão gênica em eucariontes superiores. Embora a compactação da cromatina e regulação da expressão gênica são comumente interrompidos em muitas doenças, tem faltado um locus específico, endógeno e reversível método para estudar e controlar esses mecanismos de ação. Para resolver este problema, desenvolvemos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais gene-regulação. Um componente da molécula bifuncional vincula uma âncora de ADN-proteína assim será recrutado para um locus alelo-específico. O outro componente envolve endógena cromatina-modificando maquinaria celular, recrutamento destas proteínas para um gene de interesse. Estas pequenas moléculas, chamadas químicas epigenéticas modificadores (CEMs), são capazes de controlar a expressão do gene e o ambiente de cromatina de forma dose-dependente e reversível. Aqui, detalhamos uma abordagem CEM e sua aplicação para diminuir a expressão dos genes e acetilação de cauda em um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) localizado no locus de Oct4 em células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Podemos caracterizar o chumbo CEM (CEM23) usando microscopia fluorescente, citometria de fluxo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP), seguido de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Enquanto o poder deste sistema é demonstrado no locus a Oct4 , conceitualmente, a tecnologia CEM é modular e pode ser aplicada em outros tipos de células e em outros loci genômicos.

Introdução

Cromatina consiste de DNA enrolado ao redor de proteínas octamer de histona que formam a partícula nucleosome do núcleo. Regulamento de compactação da cromatina é um mecanismo essencial para a adequada DNA expressão, replicação e reparo¹^,²^,³. Uma maneira em que as células controlam o nível de compactação é através da adição ou remoção de várias modificações de cauda de histona borne-translational. Dois tais modificações incluem acetilação de lisina (1), que é mais comumente associada com a ativação do gene, e metilação de lisina (2), que pode ser associada com ativação do gen....