P19 माउस भ्रूण कार्सिनोमा सेल लाइन (P19 सेल लाइन) व्यापक रूप से vivo विश्लेषण की तुलना में महान सरलीकरण के साथ neurogenesis के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ, हम P19 सेल लाइन में रेटिनोइक एसिड प्रेरित neurogenesis के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
एक माउस भ्रूण व्युत्पन्न teratocarcinoma से व्युत्पन्न P19 सेल लाइन तीन रोगाणु परतों में अंतर करने की क्षमता है. रेटिनोइक एसिड (आरए) की उपस्थिति में, निलंबन सुसंस्कृत P19 सेल लाइन न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जाता है। इस घटना को बड़े पैमाने पर इन विट्रो में एक neurogenesis मॉडल के रूप में जांच की है. इसलिए, P19 सेल लाइन आणविक और सेलुलर neurogenesis के साथ जुड़े अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी है. तथापि, साहित्य में वर्णित P19 कोशिका रेखा के न्यूरोनल विभेदन के लिए प्रोटोकॉल बहुत जटिल हैं। इस अध्ययन में विकसित विधि सरल कर रहे हैं और neurodevelopmental असामान्यताएं और neurodegenerative रोगों में आणविक तंत्र स्पष्ट करने में एक भूमिका निभानी होगी.
भ्रूणीय विकास के दौरान एकल कोशिका परत को तीन अलग -अलग रोगाणु परतों1,2,3में परिवर्तित कर दिया जाता है . विवो में होने वाली परिघटनाओं की अनुसंधान संभावनाओं को बढ़ाने के लिए त्रि-आयामी समुच्चयों (भ्रूण निकायों) का उत्पादन एक सुविधाजनक मॉडल के रूप में विकसित किया गया है। इस प्रकार से बनने वाले कोशिकीय समुच्चयों को विभिन्न स्थितियों से अवगत कराया जा सकता है जिससे कोशिका विभेदन उत्पन्न होता है जो भ्रूण4,5के विकास को प्रतिबिंबित करती है. P19 murine भ्रूण कार्सिनोमा सेल लाइन (P19 सेल लाइन) आमतौर पर इन विट्रो6,7,8में neurogenesis अध्ययन के लिए एक सेलुलर मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है. P19 सेल लाइन ठेठ pluripotent स्टेम सेल सुविधाओं को दर्शाती है और रेटिनोइक एसिड की उपस्थिति में न्यूरॉन्स में अंतर कर सकते हैं (आरए) सेल एकत्रीकरण के दौरान पालन शर्तों के तहत neurite outgrowth द्वारा पीछा किया. इसके अलावा, अलग-अलग पी 19 सेल लाइन डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ)9,10,11,12के प्रभाव में मांसपेशियों और कार्डियोमायोसाइट जैसी कोशिकाओं को बनाने में भी सक्षम है।
कई तरीकों13,14,15,16 न्यूरॉन भेदभाव के लिए सूचित किया गया है, लेकिन पद्धति कभी कभी जटिल है और केवल विवरण पढ़ने से समझ में आसान नहीं है. उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल कभी कभी है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मध्यम बछड़ा सीरम (सीएस) और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)13के मिश्रण के साथ पूरक का एक संयोजन की आवश्यकता है. इसके अलावा, न्यूरोनल विकास के लिए इस्तेमाल किया मीडिया अक्सर neurobasal और B27 की खुराक से बना रहे हैं13,14,15,16. जैसे, मौजूदा तरीकों में उनकी तैयारी में जटिलता होती है और हमारा लक्ष्य यहाँ प्रोटोकॉल को सरल बनाना है। इस अध्ययन में, हम प्रदर्शन किया है कि FBS के साथ DMEM P19 सेल लाइन को बनाए रखने के लिए उपयोग किया जा सकता (DMEM + 10% FBS) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन विकास के लिए (DMEM + 5% FBS + आरए). P19 सेल लाइन का उपयोग neurogenesis के लिए यह सरलीकृत विधि हमें कैसे न्यूरॉन्स विकसित कर रहे हैं की आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative रोगों पर अनुसंधान भी P19 सेल लाइन का उपयोग कर आयोजित किया जाता है17,18, और हमें विश्वास है कि इस अध्ययन में विकसित विधि स्पष्ट करने में एक भूमिका निभानी होगी neurodevelopmental असामान्यताओं और neurodegenerative रोगों में आणविक तंत्र.
यहाँ, हम Neurogenesis के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन P19 सेल लाइन का उपयोग कर. हालांकि इस संबंध में कई रिपोर्टों को प्रकाशित किया गया है, P19 सेल लाइन का उपयोग कर neurogenesis प्रेरण के लिए एक विस्तृत पद्धति स्पष्ट नहीं है. ?…
The authors have nothing to disclose.
अध्ययन वित्तीय राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड द्वारा समर्थित किया गया था (नहीं अनुदान. UMO-2017/25/N/N/N/N/N/N/N/01886) और KNOW (लीडिंग नेशनल रिसर्च सेंटर) वैज्ञानिक कंसोर्टियम “स्वस्थ पशु – सुरक्षित खाद्य”, विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय का निर्णय संख्या 05-1/
6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
Cell Culture Plastics | |||
1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |