Den P19 musen embryonale kreftcelle linje (P19 cellelinje) er mye brukt for å studere den molekylære mekanismen av neurogenesis med stor forenkling i forhold til in vivo analyse. Her presenterer vi en protokoll for retinoic acid-indusert neurogenesis i P19 cellelinjen.
Den P19 cellelinje avledet fra en mus embryo-avledet teratocarcinoma har evnen til å differensiere til tre bakterie lag. I nærvær av retinoic syre (RA), suspensjonen kultivert P19 cellelinjen er indusert å differensiere til neurons. Dette fenomenet undersøkes i stor utstrekning som en neurogenesis modell in vitro. Derfor er P19 cellelinjen svært nyttig for molekylær og cellulær studier knyttet til neurogenesis. Men protokoller for neuronal differensiering av P19 cellelinje beskrevet i litteraturen er svært komplekse. Metoden utviklet i denne studien er enkel og vil spille en rolle i Elucidating av molekylære mekanismer i neurodevelopmental unormalt og nevrodegenerative sykdommer.
Under embryoutvikling omdannes et enkelt celle lag til tre separate bakterie lag1,2,3. For å øke forsknings mulighetene for fenomener som forekommer i Vivo, har generering av tredimensjonale aggregater (embryonale organer) blitt utviklet som en praktisk modell. Cellulære aggregater dannet på denne måten kan utsettes for ulike forhold forårsaker celle differensiering, som reflekterer utviklingen av embryo4,5. P19 murine embryonale kreftcelle linje (P19 cellelinje) brukes vanligvis som en cellulær modell for neurogenesis studier in vitro6,7,8. Den P19 cellelinjen utstillinger typiske pluripotent stilk cellen funksjoner og kan differensiere til neurons i nærvær av retinoic syre (RA) under celle aggregering etterfulgt av neurite utvekst under tilhenger forhold. Videre er udifferensierte P19 cellelinje også i stand til å forme muskel-og cardiomyocyte-lignende celler under påvirkning av dimethyl sulfoxide (DMSO)9,10,11,12.
Mange metoder13,14,15,16 har blitt rapportert for neuronal differensiering, men metodikken er noen ganger komplisert og ikke lett å forstå ved bare å lese beskrivelsene. For eksempel, protokoller noen ganger krever en kombinasjon av Dulbecco ‘ s modifisert Eagle medium (DMEM) medium supplert med en blanding av kalv serum (CS) og fosterets storfe serum (FBS)13. Videre medier brukes for neuronal utvikling er ofte sammensatt av Neurobasal og B27 kosttilskudd13,14,15,16. Som sådan, eksisterende metoder inneholder kompleksitet i forberedelsene og vårt mål her er å forenkle protokollene. I denne studien, viste vi at DMEM med FBS kan utnyttes for å opprettholde P19 cellelinjen (DMEM + 10% FBS) samt for neuronal utvikling (DMEM + 5% FBS + RA). Denne forenklede metoden for neurogenesis ved hjelp av P19 cellelinje tillater oss å studere den molekylære mekanismen av hvordan neurons utvikles. Videre er forskning på nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom også gjennomført ved hjelp P19 cellelinje17,18, og vi tror at metoden utviklet i denne studien vil spille en rolle i Elucidating molekylære mekanismer i neurodevelopmental unormalt og nevrodegenerative sykdommer.
Her beskriver vi en enkel protokoll for neurogenesis ved hjelp av P19 cellelinje. Selv om mange rapporter har blitt publisert i denne forbindelse, er en detaljert metodikk for neurogenesis induksjon bruker P19 cellelinje uklart. Videre benyttet vi en enkel høy glukose (4 500 mg/L) DMEM medium med 10% FBS for hele eksperimentet. Dette tillot oss å utføre neurogenic eksperimentet på en brukervennlig måte og utvide bruken av denne metoden for fremtiden.
De mest kritiske punktene i denne prot…
The authors have nothing to disclose.
Studien ble økonomisk støttet av National Science Centre, Polen (Grant no. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) og KNOW (ledende nasjonalt forskningssenter) vitenskapelig konsortium “sunn dyr-trygg mat”, vedtak av departementet for vitenskap og høyere utdanning no. 05-1/KNOW2/2015
6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
Cell Culture Plastics | |||
1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |