Neurogênese usando células de Carcinoma embrionário P19

Resumo

A linha celular da carcinoma embrionária do rato P19 (linha celular P19) é amplamente utilizada estudando o mecanismo molecular da neurogênese com grande simplificação comparada à análise in vivo. Aqui, nós apresentamos um protocolo para o neurogênese ácido-induzido retinóico na linha celular P19.

Resumo

A linha celular P19 derivada de um teratocarcinoma embrião-derivado do rato tem a habilidade de diferenciar-se nas três camadas do germe. Na presença de ácido retinóico (RA), a suspensão cultivada linha celular P19 é induzida para diferenciar em neurônios. Este fenômeno é extensivamente investigado como um modelo de neurogênese in vitro. Portanto, a linha celular P19 é muito útil para estudos moleculares e celulares associados à neurogênese. Entretanto, os protocolos para a diferenciação neuronal da linha celular de P19 descritos na literatura são muito complexos. O método desenvolvido neste estudo é simples e vai desempenhar um papel na elucidatação dos mecanismos moleculares em anormalidades NEURODESENVOLVIMENTAIS e doenças neurodegenerativas.

Introdução

Durante o desenvolvimento embrionário, uma única camada de células é transformada em três camadas germinativas separadas^1,2,3. Para aumentar as possibilidades de pesquisa de fenômenos ocorridos in vivo, a geração de agregados tridimensionais (corpos embrionários) tem sido desenvolvida como um modelo conveniente. Agregados celulares formados dessa forma podem ser expostos a várias condições que causam diferenciação celular, o que reflete o desenvolvimento do embrião^4,5. A linha celular de Carcinoma embrionário P19 muri....

Protocolo

1. manutenção da cultura

1. Cultura da linha celular P19 em meio de manutenção (Dulbecco ' s modificado meio Eagle ' s com 4.500 mg/L de glicose suplementada com 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 unidades/mL de estreptomicina). Incubar a 37 ° c e 5% CO₂.

2. sub-culturas de células

1. Quando as células atingem aproximadamente 80% de confluência, retire o meio gasto das garrafas de cultura celular (área de superfície 25 cm²).
2. Lave as células com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) livre de cálcio e magnésio.
3. Adicione 1 mL de 0,25% de tripsina-EDTA (ácido e....

Resultados

O esquema simplificado de protocolo para indução de neurogênese em linha celular P19 é apresentado na Figura 1. Para definir o caráter da linhagem celular P19 em um estado indiferenciado e durante a neurogênese, utilizou-se o método RT-PCR (reação em cadeia da transcrição-polimerase reversa). A linha celular P19 não diferenciada expressou os genes de pluripotência como cátion orgânico/carnitina transporter4 (Oct4) e NANOG homeobox (NANOG). A.......

Discussão

Aqui, nós descrevemos um protocolo simples para a neurogênese usando a linha celular P19. Embora muitos relatórios tenham sido publicados a este respeito, uma metodologia detalhada para a indução da neurogênese usando a linha celular P19 permanece obscura. Além disso, utilizou-se um meio DMEM de glicose (4.500 mg/L) de alta simples com 10% de FBS para todo o experimento. Isso nos permitiu realizar o experimento neurogênico de forma amigável e ampliar o uso desse método para o futuro.

Os pontos.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
6x Corante de Carregamento de DNA	EURx	E0260-01
Agarose	Sigma- Aldrich	A9539
kit de síntese de cDNA	EURx	E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-fenilindol dicloridrato)	Sigma- Aldrich	10236276001	Concentração de trabalho: 1 μ g/mL
DMEM glicose alta (4,5 g/L) com L-glutamina	Lonza	BE12-604Q
Etanol 99,8%	Chempur	CHEM*613964202
Soro Fetal Bovino (FBS)	EURx	E5050-03
MAP2 anticorpo	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Diluição 1:100
Kit de reação PCR	EURx	E0411-03
Penicilina/Estreptomicina 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrado sem Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Ácido retinóico	Sigma- Aldrich	R2625-50MG&	nbsp; dissolvido em etanol a 99,8%; armazenar em -20 ° C até 6 meses
Anticorpo Secundário (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Diluição 1:500
Leite desnatado	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE Buffer	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Tripsina 0,25% - EDTA em HBSS, sem  Ca2+, Mg2+, com	biossoro	LM-T1720/500
			cultura de células
1 mL Pipetas sorológicas	Profilab	515.01
Pipetas sorológicas de 10 mL	Profilab	515.10
Prato de 100 mm dedicado à cultura em suspensão	Corning	C351029
Tubos de centrífuga de 15 mL	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
Pipetas sorológicas de 5 mL	Profilab	515.05
Placa de 6 poços	Corning	CLS3516
Frascos de cultura de células, área de superfície 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA

vermelho de fenol Plásticos de