Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성
Summary
여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.
Abstract
CRISPR/Cas9 기술 많은 세포 유형, 하지만 지금까지 유전자 배달에 게놈 엔지니어링 가속 되 고 안정적인 유전자 수정 기본 NK 세포에 도전 되었습니다. 예를 들어 transgene 배달 lentiviral 또는 retroviral 변환을 사용 하 여 실질적인 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis 때문 NK 세포 유전자 조작의 제한 된 수율 결과. 여기 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 게놈 편집용 DNA 무료 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 TGFBR2 와 의 효율적인 녹아웃 NK 세포에 HPRT1 유전자 허용. RT-PCR 데이터 유전자 식 수준에 중요 한 감소 그리고 대표적인 셀 제품의 세포 독성 분석 실험 제안 RNP 수정 NK 세포 TGFβ에 덜 민감한 되었다. 유전자 변형된 세포 조사 mbIL21 표현 된 자극에 의해 확장 된 게시물 electroporation 수 지류 세포.
Introduction
암 immunotherapy 최근 몇 년 동안에서 고급 되었습니다. 유전자 변형 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포는 암 immunotherapy에 성공적으로 배포 하는 설계 된 면역 세포의 훌륭한 예입니다. 이 셀 최근에 대 한 처리를 위한 FDA에 의해 승인 되었다 CD19 + B 세포 악성 종양, 하지만 성공 지금까지 몇 대상 항, 베어링 질병에 국한 되었으며 같은 제한 된 항 원 레파토리를 대상으로 하는 것은 면역 탈출 하 여 실패 하는 경향이. 또한, 자동차 T 세포 이식-비교-호스트 질병 수용자 T 세포에 의해 발생의 헌 T 세포의 사용에 집중 되었습니다 했다. 반면, NK 세포는 종양 표적 항 원 독립적인 방식으로 죽 일 수 있으며 GvHD, 그들에 게 암 immunotherapy6,7,,89에 대 한 좋은 후보를 발생 하지 않습니다.
CRISPR/Cas9 기술 최근 엔지니어링 면역 세포에서 사용 되었습니다 하지만 NK 세포는 플라스 미드 유전자 재프로그래밍 항상 도전 하고있다. 이것은 lentiviral 및 retroviral 변환 상당한 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis와 유전자 조작된 NK 세포4 의 제한 된 생산 유발 등 DNA 의존 방식에서 transgene 배달에 어려움으로 인해 되었습니다. , 9.
많은 타고 난 면역 세포 표현 병원 체 관련 된 분자 패턴에 대 한 수용 체의 상부와 같은 Retinoic 산을 유도할 수 있는 유전자 나 (장비-난), 어떤 외국 DNA의 과장 된 인식의 사용. 유전 수정10DNA 기반 방법을 사용 하 여 때 이러한 통로의 억제 NK 세포에 더 높은 변환 효율을 수 있게 되었습니다.
여기는 DNA 무료 게놈의 편집 기본 및 확장 된 인간 NK 세포 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 활용 하 여 사용 하기 위한 방법을 설명 합니다. Cas9/RNPs는 세 가지 구성 요소, 재조합 Cas9 단백질에 complexed 합성 단일 가이드 RNA complexed crRNA와 tracerRNA의 구성으로 이루어져 있습니다. 이러한 Cas9/RNPs 기능 복합물으로 그들의 배달으로 인해 외국 DNA 종속 접근 높은 효율으로 게놈 목표를 고착 할 수 있다. 또한, Cas9/RNPs 세포에서의 신속한 통관 apoptosis 유도 등 대상 오프 효과 줄일 수 있습니다. 따라서, 그들은 노크-아웃, 또는 동종 재결합6,7에 대 한 DNA와 결합 될 때 노크 기능 생성을 사용할 수 있습니다. 우리는 Cas9/RNPs의 그 electroporation 보였다 NK 세포에서 유전자 조작의 이전 제약을 극복 하는 간단 하 고 비교적 효율적인 방법입니다.
TGFβ는 활성화 및 NK 세포의 기능을 억제 하는 주요 면역 억제 사이토카인 이다. 그것은 TGFβ 통로 대상으로 면역 세포 기능을 높일 수 있습니다 제안 되었습니다. 우리 TGBR2 ectodomain TGFβ11. 을 바인딩하는 인코딩 지역 대상 대표 결과이 유전자의 mRNA 발현의 수준에 상당한 감소를 표시 하 고 추가 수정 된 NK 세포가 TGFβ에 저항력이 될 입증. 또한, 수정 된 셀 유지 생존 및 증식 잠재력, 그들은 확장 된 게시물 electroporation에 비친된 피더 세포. 을 사용 하 여 될 수 있다 따라서, 다음 메서드는 유전자에 대 한 NK 세포를 조작 하는 유망한 접근 방식을 추가 임상 또는 연구 목적.
Protocol
Representative Results
Discussion
NK 세포의 DNA-종속 수정4,9도전 하고있다. 우리는, 따라서, 도입 직접 종합적으로 미리 형성한 ribonucleoprotein (RNPs) 복잡 하 고 Cas9 단백질 순화 된 단백질으로 기본 및 확장 된 NK 세포8로. 이 방법은 미행, 상한, 제거를 허용 하 고 다른 transcriptional 및 변환 프로세스는 RNA 중 합 효소 II는 DNA 의존 변환 메서드에 연결 된 NK 세포 apoptosis를 발생…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고 편집에 그의 친절 한 도움에 대 한 브라이언 툴 리를 인정 합니다.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
Referências
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