Generation av Knock-out primära och utökade mänskliga NK-celler använder Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att genetiskt modifiera primär eller utökad mänskliga naturliga mördarceller (NK) celler använder Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Med hjälp av detta protokoll, genererade vi mänskliga NK celler bristfällig för omvandla tillväxtfaktor – b receptor 2 (TGFBR2) och hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 teknik accelererar genomet engineering i många celltyper, men hittills har gen leverans och stabil genmodifiering har varit utmanande i primära NK-celler. Till exempel resulterade transgenens leverans med hjälp av lentiviral eller retrovirala transduktion i en begränsad avkastning av genetiskt manipulerade NK-celler på grund av betydande förfarande-associerade NK cell apoptos. Vi beskriver här en DNA-fri metod för editering av mänskliga primära och utökade NK celler använder Cas9 ribonukleoprotein komplex (Cas9/RNPs). Denna metod får effektiv knockout TGFBR2 och HPRT1 gener i NK-celler. RT-PCR data visade en signifikant minskning i gen uttryck nivå, och en cytotoxicitet analys av en representativ cellen produkt föreslog att RNP-modifierade NK-celler blev mindre känslig för TGFβ. Genetiskt modifierade celler kan vara utökade post-elektroporation genom stimulering med bestrålat mbIL21-uttryckande feeder celler.
Introduction
Immunterapi mot cancer har varit avancerade under de senaste åren. Genetiskt modifierade chimära antigen receptorn (bil) T-celler är ett utmärkt exempel på modifierade immunceller som distribuerats i cancer immunoterapi. Dessa celler har nyligen godkänts av FDA för behandling mot CD19 + B cell maligniteter, men framgången har hittills begränsats till sjukdomar med några targetable antigener, och inriktning på sådan begränsad antigena repertoarer är benägna att misslyckas immun flykten. Dessutom har CAR T-celler varit inriktad på användningen av autologa T-celler på grund av graft – versus – host sjukdom orsakas av allogena T-celler. I kontrast, NK-celler kan döda tumör mål på ett antigen-oberoende sätt och orsakar inte GvHD, vilket gör dem en bra kandidat för cancer immunoterapi6,7,8,9.
CRISPR/Cas9-teknik har använts nyligen i engineering immunceller, men genetiskt omprogrammering NK-celler med plasmider har alltid varit en utmaning. Detta har varit på grund av svårigheter i transgenens leverans på ett DNA beroende sätt såsom lentiviral och retrovirala transduktion orsakar betydande förfarande-associerade NK cell apoptos och begränsad produktion av genmanipulerade NK celler4 , 9.
Många medfödda immunceller uttrycka höga nivåer av receptorer för patogen-associerade molekylära mönster såsom Retinoic acid-inducerbara gen jag (RIG-jag), som gör det möjligt för förhöjd erkännande av främmande DNA. Dämpning av dessa vägar har aktiverat högre transduktion effektivitet i NK-celler när du använder DNA-baserade metoder för genetisk modifiering10.
Här beskriver vi metoden för att använda en DNA-fria gen editering av primära och utökade mänskliga NK celler utnyttja Cas9 ribonukleoprotein komplex (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs består av tre komponenter, rekombinanta Cas9 protein komplex med syntetiska singel-guide RNA består av en komplex crRNA och tracerRNA. Dessa Cas9/RNPs klarar av att klyva genomisk mål med högre effektivitet jämfört med utländska DNA-beroende tillvägagångssätt på grund av deras leverans som funktionella komplex. Snabb clearance av Cas9/RNPs från cellerna kan dessutom minska de off-target effekterna såsom induktion av apoptos. De kan således användas för att generera knock-outs eller knock-ins när de kombineras med DNA för homolog rekombination6,7. Vi visade att elektroporation av Cas9/RNPs är en enkel och relativt effektiv metod som övervinner de tidigare begränsningarna av genetisk modifiering i NK-celler.
TGFβ är en större immunsuppressiva cytokin, som hämmar aktivering och funktioner av NK-celler. Det har föreslagits att inriktning TGFβ vägen kan öka immunceller funktioner. Vi riktade regionen kodning TGBR2 ectodomain som binder TGFβ11. De representativa resultat visar en signifikant minskning i nivån av mRNA-uttryck av denna gen och vidare Visa att de modifierade NK-cellerna bli resistenta mot TGFβ. Dessutom behålla modifierade cellerna livskraft och proliferativ potential, eftersom de kan vara utökade post-elektroporation använder bestrålat feeder celler. Därför följande metod är en lovande strategi att genetiskt manipulera NK-celler för någon ytterligare klinisk eller forskningsändamål.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-beroende modifiering av NK-celler har utmanande4,9. Vi, därför infört direkt ett syntetiskt förformade ribonukleoprotein (RNPs) komplex och Cas9 protein som renat protein in i primära och utökade NK celler8. Denna metod tillät oss att eliminera tak, förföljer, och andra transkriptionell och translationell processer Startat av RNA-polymeras II, vilket kan orsaka NK cell apoptos är associerad med DNA-beroende transduktion metod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Brian Tullius för hans vänliga hjälp i redigering manuskriptet.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
Referências
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Pesquisa do Câncer. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
