Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.
Abstract
CRISPR/Cas9 Technologie beschleunigt sich Genom-Technik in vielen Zelltypen, aber so weit gen Lieferung und stabile gentechnische Veränderung im primären NK-Zellen herausfordernd gewesen. Transgen-Lieferung mit Lentivirale oder retrovirale Transduktion führte beispielsweise in einer begrenzten Ausbeute von gentechnisch NK-Zellen durch erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptose. Wir beschreiben hier eine DNA-freie Methode für Genom-Bearbeitung von menschlichen Grund- und erweiterten NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Diese Methode erlaubt effiziente ko von TGFBR2 und HPRT1 Gene in NK-Zellen. RT-PCR-Daten zeigten eine signifikante Abnahme der Gen-Expression-Ebene, und ein Zytotoxizität Assay eines repräsentativen Zelle Produkts vorgeschlagen, dass die RNP-modifizierte NK-Zellen weniger empfindlich auf TGFβ wurde. Genetisch veränderte Zellen möglicherweise erweiterte Post-Elektroporation durch Stimulation mit bestrahlten mbIL21 exprimierenden Feeder-Zellen.
Introduction
Krebs-Immuntherapie wurde in den letzten Jahren vorgebracht worden. Genetisch veränderte chimeric Antigen-Rezeptor (Auto)-T-Zellen sind ein hervorragendes Beispiel von veränderter Immunzellen erfolgreich in Krebsimmuntherapie eingesetzt. Diese Zellen wurden vor kurzem genehmigt durch die FDA für die Behandlung gegen CD19 + B-Zell-Tumoren, aber Erfolg ist bisher beschränkt sich auf Krankheiten, die mit ein paar Aktionsleisten Antigene und targeting so begrenzten Antigen Repertoire ist anfällig für Fehler durch immun Flucht. Darüber hinaus haben Auto-T-Zellen auf die Verwendung von autologen T-Zellen wegen der Gefahr der Graft – Versus – Host-Seuche verursacht durch allogenen T-Zellen konzentriert. Im Gegensatz dazu, NK-Zellen sind in der Lage, Tumor Zielen auf ein Antigen-unabhängige Weise zu töten und verursachen keine GvHD, wodurch sie einen guten Kandidat für Krebs Immuntherapie6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 Technologie wurde vor kurzem in engineering Immunzellen verwendet, aber genetisch Umprogrammierung NK-Zellen mit Plasmiden seit jeher schwierig. Dies wurde aufgrund von Schwierigkeiten bei Transgen Lieferung in einer DNA-abhängigen Weise wie Lentivirale und retrovirale Transduktion verursacht erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptosis und der begrenzten Produktion gentechnisch NK-Zellen-4 , 9.
Viele angeborene immune Zellen express hohes Maß an Rezeptoren für Pathogen-assoziierte molekulare Muster wie Retinoic Säure-induzierbaren gen ich (RIG-ich), die es ermöglichen erhöhte Anerkennung von Fremd-DNA. Unterdrückung dieser Wege hat höhere Effizienz der Transduktion in NK-Zellen aktiviert, bei Verwendung von DNA-basierten Methoden für gentechnische Veränderung10.
Hier beschreiben wir die Methode für die Verwendung einer DNA-freie-Genom-Bearbeitung von primären und erweiterten menschlichen NK-Zellen unter Verwendung Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs besteht aus drei Komponenten, rekombinante Cas9 Protein komplexiert mit synthetischen Single-Guide RNA, bestehend aus einem komplexierten CrRNA und TracerRNA. Diese Cas9/RNPs sind in der Lage Spalten genomische Ziele mit einem höheren Wirkungsgrad im Vergleich zu ausländischen DNA-abhängige Ansätze aufgrund ihrer Lieferung als funktionelle komplexe. Darüber hinaus kann schnelle Abfertigung von Cas9/RNPs aus den Zellen der Ziel-Effekte wie Induktion der Apoptose reduzieren. So dienen sie Durchbrüche oder Knock-ins für homologe Rekombination6,7in Kombination mit DNA zu erzeugen. Wir haben gezeigt, dass Elektroporation von Cas9/RNPs ist eine einfache und relativ effiziente Methode, die die bisherigen Einschränkungen der gentechnischen Veränderung in NK-Zellen überwindet.
TGFβ ist eine große immunsuppressive Cytokine, die die Aktivierung und Funktionen von NK-Zellen hemmt. Es wurde vermutet, dass targeting TGFβ Weg Immunzelle Funktionen erhöhen kann. Wir gezielt die Region Codierung TGBR2 ektodomäne die bindet TGFβ11. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen einen deutlichen Rückgang der Ebene der mRNA Expression dieses Gens und weiteren zeigen, dass die veränderten NK-Zellen gegen TGFβ resistent geworden. Darüber hinaus behalten die veränderten Zellen Lebensfähigkeit und proliferative Potential, wie sie in der Lage, erweiterte Post-Elektroporation mit bestrahlten Feeder-Zellen. Daher die folgende Methode ist ein vielversprechender Ansatz zur NK-Zellen genetisch manipulieren, für jeden weiteren klinischen oder wissenschaftliche Zwecke.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-abhängige Änderung der NK-Zellen hat4,9streitig gemacht. Wir, stellten daher direkt eine synthetisch vorgeformten Ribonucleoprotein (RNPs) Komplex und Cas9 Protein als gereinigtes Protein in Grund- und erweiterten NK Zellen8. Diese Methode erlaubte uns, Deckelung, zu beseitigen, Beschatten, und andere transkriptionelle und translationalen Prozesse gestartet durch RNA-Polymerase II, die NK Zelle Apoptose DNA-abhängige Signaltransdukt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen Brian Tullius für seine freundliche Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
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