टिक अगली पीढ़ी 16S rRNA Amplicon अनुक्रमण द्वारा Microbiome लक्षण वर्णन
Summary
यहाँ हम 16S rRNA sequencing जो पहचान और वैक्टर के भीतर माइक्रोबियल समुदायों के लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है के लिए एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि डीएनए निष्कर्षण, प्रवर्धन और पीसीआर के माध्यम से नमूनों की barcoding, एक प्रवाह-सेल पर अनुक्रमण, और वंशावली जानकारी के लिए अनुक्रम डेटा से मेल करने के लिए bioinformatics शामिल है ।
Abstract
हाल के दशकों में, वेक्टर जनित रोगों फिर से उभरा है और खतरनाक दरों पर विस्तार किया है, काफी रुग्णता और दुनिया भर में मृत्यु के कारण । प्रभावी और व्यापक रूप से उपलब्ध टीकों इन रोगों के बहुमत के लिए कमी कर रहे हैं, उपंयास रोग शमन रणनीतियों के विकास necessitating । इस अंत करने के लिए, रोग नियंत्रण के एक होनहार एवेंयू वेक्टर microbiome लक्ष्यीकरण शामिल है, रोगाणुओं के समुदाय वेक्टर का निवास । वेक्टर microbiome रोगज़नक़ गतिशीलता में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, और microbiome के जोड़तोड़ वेक्टर जनित रोगों के एक मुट्ठी भर के लिए कम वेक्टर बहुतायत या रोगज़नक़ संचरण के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि, रोग नियंत्रण अनुप्रयोगों में इन निष्कर्षों का अनुवाद वेक्टर माइक्रोबियल पारिस्थितिकी की एक पूरी तरह से समझ की आवश्यकता है, ऐतिहासिक इस क्षेत्र में अपर्याप्त प्रौद्योगिकी द्वारा सीमित । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के आगमन तेजी से सक्षम है, विविध माइक्रोबियल समुदायों के अत्यधिक समानांतर अनुक्रमण । लक्ष्यीकरण अत्यधिक-संरक्षित 16S rRNA जीन अलग पारिस्थितिकी और प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत वैक्टर के भीतर मौजूद रोगाणुओं के characterizations की सुविधा है । इस तकनीक 16S rRNA जीन का प्रवर्धन, पीसीआर के माध्यम से barcoding नमूना शामिल है, अनुक्रमण के लिए एक प्रवाह सेल पर नमूने लोड हो रहा है, और bioinformatics दृष्टिकोण वंशावली जानकारी के साथ अनुक्रम डेटा मैच के लिए । एक उच्च संख्या के लिए प्रजातियों या जीनस-स्तर की पहचान आमतौर पर इस दृष्टिकोण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार पारंपरिक संवर्धन, माइक्रोस्कोप, या ऊतकवैज्ञानिक धुंधला से कम पता लगाने, संकल्प, और उत्पादन की चुनौतियों को दरकिनार तकनीक. इसलिए, इस विधि निस्र्पक वेक्टर रोगाणुओं के लिए विभिंन स्थितियों के तहत अच्छी तरह से अनुकूल है, लेकिन वर्तमान में माइक्रोबियल समारोह के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकते, वेक्टर के भीतर स्थान, या एंटीबायोटिक उपचार के लिए प्रतिक्रिया । कुल मिलाकर, 16S अगली पीढ़ी के अनुक्रमण बेहतर पहचान और रोग गतिशीलता में वेक्टर रोगाणुओं की भूमिका को समझने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है ।
Introduction
हाल के दशकों में वेक्टर जनित रोगों का पुनरुत्थान और प्रसार वैश्विक मानव और वन्यजीव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करता है । प्रभावी टीके इन रोगों के बहुमत के लिए कमी कर रहे हैं, और नियंत्रण के प्रयासों वैक्टर और वेक्टर-मेजबान बातचीत के जटिल जैविक प्रकृति द्वारा रुकावट हैं । रोगज़नक़ संचरण में एक सदिश के भीतर माइक्रोबियल बातचीत की भूमिका को समझना उपंयास रणनीतियों जो इन चुनौतियों को दरकिनार के विकास के लिए अनुमति दे सकते हैं । विशेष रूप से, वेक्टर जुड़े माइक्रोबियल commensals, symbionts, और रोगजनकों, microbiome के रूप में संदर्भित के बीच बातचीत, रोगज़नक़ संचरण के लिए महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं । भारी सबूत अब इस जोर का समर्थन करता है, वेक्टर microbiome और मलेरिया के रूप में रोगों के लिए क्षमता के बीच एक कड़ी का प्रदर्शन उदाहरण के साथ, Zika वायरस, और लाइम रोग1,2,3। हालांकि, रोग नियंत्रण के लिए रणनीतियों में इन निष्कर्षों का अनुवाद संरचना, समारोह के एक कहीं अधिक विस्तृत समझ की आवश्यकता है, और वेक्टर microbiomes की उत्पत्ति । पारिस्थितिकी और प्रायोगिक परिस्थितियों के तहत वेक्टर माइक्रोबियल समुदाय की पहचान और लक्षण वर्णन इस क्षेत्र में आगे एक महत्वपूर्ण पथ का गठन ।
एक रोगज़नक़ के माइक्रोबियल निवासियों की पहचान करने के लिए एक प्रक्रिया यहां पश्चिमी काले पैर टिक, Ixodes pacificus, लाइम रोग रोगज़नक़ अरै burgdorferiकी एक वेक्टर प्रजातियों का उपयोग करके प्रदान की जाती है । जबकि किसी भी अंय सन्धिपाद से मानव रोगजनकों के अधिक प्रकार के बंदरगाह ticks, अपेक्षाकृत कम टिक microbiomes4के जीव विज्ञान और सामुदायिक पारिस्थितिकी के बारे में जाना जाता है । यह स्पष्ट है कि ticks बंदरगाह वायरस, बैक्टीरिया, कवक, और protozoans जो commensals, endosymbionts, और परिवर्तनीय माइक्रोबियल निवासियों5,4शामिल है की एक विविध सरणी । पहले काम भूगोल, प्रजातियों, लिंग, जीवन स्तर, और रक्त भोजन के स्रोत6,7,8के साथ जुड़े Ixodes microbiomes में मजबूत बदलाव का प्रदर्शन किया है । हालांकि, इस भिन्नता अंतर्निहित तंत्र अज्ञात रहते हैं और इन माइक्रोबियल समुदायों के मूल और विधानसभा के अधिक विस्तृत जांच वारंट. ticks ऊर्ध्वाधर संचरण, मेजबान के साथ संपर्क के माध्यम से रोगाणुओं प्राप्त कर सकते हैं, और spiracles, मुंह के माध्यम से पर्यावरण से ऊपर, और गुदा ताकना9। प्रारंभिक गठन और टिक microbiome के विकास को आकार देने कारकों को समझने, विशेष रूप से ऊर्ध्वाधर और पर्यावरण संचरण के सापेक्ष योगदान, प्राकृतिक पैटर्न और टिक में बदलाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है microbiome विविधता और कैसे इन समुदायों रोगज़नक़ संचरण के दौरान, रोग या वेक्टर नियंत्रण के लिए संभव अनुप्रयोगों के साथ बातचीत ।
इस तरह की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में शक्तिशाली आणविक तकनीक, अब माइक्रोबियल समुदायों की पहचान के लिए मौजूद है और विविध पर्यावरणीय या प्रयोगात्मक शर्तों के तहत वेक्टर microbiomes की विशेषता के लिए नियोजित किया जा सकता है । इन उच्च प्रवाह अनुक्रमण दृष्टिकोण के आगमन से पहले, सूक्ष्मता और संस्कृति पर मुख्य रूप से भरोसा रोगाणुओं की पहचान । जबकि माइक्रोस्कोपी एक तेजी से और आसान तकनीक है, रोगाणुओं की पहचान के लिए रूपात्मक तरीकों स्वाभाविक व्यक्तिपरक और मोटे और कम संवेदनशीलता और10का पता लगाने के द्वारा सीमित कर रहे हैं । संस्कृति आधारित विधियों मोटे तौर पर माइक्रोबियल पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है और दवा उपचार के लिए रोगाणुओं की संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है11। हालांकि, इस विधि भी कम संवेदनशीलता से ग्रस्त है, के रूप में यह अनुमान लगाया गया है कि पर्यावरण रोगाणुओं से कम 2% एक प्रयोगशाला12में स्थापित किया जा सकता है । ऊतकवैज्ञानिक धुंधला दृष्टिकोण भी पता लगाने के लिए नियोजित किया गया है और वैक्टर के भीतर विशिष्ट रोगाणुओं स्थानीयकरण, टिक के भीतर विभिंन taxa वितरण की जांच सक्षम करें, और अध्ययन माइक्रोबियल बातचीत के बारे में परिकल्पना । हालांकि, माइक्रोबियल पहचान के पहले ज्ञान उपयुक्त दाग का चयन करने के लिए आवश्यक है, इस दृष्टिकोण बीमार माइक्रोबियल लक्षण वर्णन और पहचान के लिए अनुकूल बना । इसके अलावा, ऊतकवैज्ञानिक धुंधला एक उच्च समय गहन, श्रमसाध्य प्रक्रिया है और बड़े नमूना आकार के लिए अच्छी तरह से पैमाने पर नहीं है । ऐसे सैंज अनुक्रमण के रूप में पारंपरिक आणविक दृष्टिकोण इसी तरह उनकी संवेदनशीलता और विविध माइक्रोबियल समुदायों का पता लगाने में सीमित हैं ।
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण नमूनों की एक बड़ी संख्या से रोगाणुओं की तेजी से पहचान के लिए अनुमति देता है । मानक मार्कर जीन और संदर्भ डेटाबेस की उपस्थिति आगे बढ़ाया वर्गीकरण संकल्प, अक्सर जीनस या प्रजातियों के स्तर के लिए सक्षम बनाता है । लघु इकाई राइबोसोमल RNAs अक्सर इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, 16S rRNA के साथ सबसे आम की उपस्थिति के कारण संरक्षित और जीन के भीतर चर क्षेत्रों, एक जीवाणु के लिए अद्वितीय amplicons के साथ यूनिवर्सल प्राइमरी के निर्माण के लिए अनुमति प्रजाति13,14. यह रिपोर्ट विवरण 16S rRNA अगली पीढ़ी sequencing के माध्यम से टिक microbiome में taxa की पहचान करने के लिए एक प्रक्रिया है । विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल sequencing के लिए नमूने तैयार करने में शामिल चरणों पर बल देता है । sequencing और bioinformatics चरणों पर अधिक सामान्यीकृत विवरण प्रदान किए जाते हैं, के रूप में वहाँ अनुक्रमण प्लेटफार्मों और विश्लेषण वर्तमान में उपलब्ध कार्यक्रमों की एक किस्म है, व्यापक मौजूदा प्रलेखन के साथ प्रत्येक. इस अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के समग्र व्यवहार्यता एक प्रमुख रोग वेक्टर के भीतर माइक्रोबियल समुदाय विधानसभा की एक जांच करने के लिए इसे लागू करने के द्वारा प्रदर्शन किया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण माइक्रोबियल पहचान के लिए एक मानक दृष्टिकोण बन गया है और कैसे वेक्टर microbiomes रोगज़नक़ संचरण को प्रभावित का अध्ययन सक्षम होना चाहिए । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल pacificus, लाइम रोग ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था एएस (देब #1427772, १७४५४११, १७५००३७) के लिए अनुदान ।
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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