Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar
Summary
Biz petrol su microemulsions içinde Xenopus laevis yumurta özleri Kapsüllenen tarafından vitro kendini sürekli mitotik salınımlarını tek hücre düzeyinde nesil için bir yöntem mevcut.
Abstract
Gerçek zamanlı ölçüm salınımlarını tek hücre düzeyinde biyolojik saatler mekanizmaları ortaya çıkarmak önemlidir. Xenopus laevis yumurtadan hazırlanan toplu özleri biyokimyasal ağlar hücre döngüsü ilerleme temel anatomi güçlü olmasına rağmen kendi topluluğu ortalama ölçüm genellikle her rağmen damped bir salınım yol açar bireysel osilatör sürekli. Bu bireysel osilatörler arasında mükemmel senkronizasyon zorluk gürültülü biyolojik sistemlerde kaynaklanmaktadır. Osilatör tek hücre dinamiği almak için mitotik döngüleri hücre benzeri bölmeleri Xenopus laevis yumurta Bisiklete binme sitoplazmik özleri Kapsüllenen sulandırmak bir yapay hücre damlacık tabanlı sistem geliştirdi. Bu basit salt sitoplazmik hücreler sürekli salınım 30’dan fazla devredir sergi. Çekirdeği ile daha karmaşık hücreleri oluşturmak için demembranated sperm kromatin çekirdeği, kendinden montajlı sistemdeki tetiklemek için eklendi. Biz kromozom yoğunlaşma/decondensation periyodik bir ilerleme gözlenen ve çekirdek dökümü/reformasyon, gibi gerçek hücrelerde örtmek. Bu mitotik osilatör sadakatle birden çok akış aşağı mitotik olay sürücü çalışmasını gösterir. Aynı anda mitotik osilatör ve bireysel damlacıkları çok kanallı hızlandırılmış floresans mikroskobu kullanarak karşıdan akış süreçlerinde dinamiklerini tespit ettik. Yapay hücre döngüsü sistem yüksek üretilen iş çerçeve nicel manipülasyon ve mitotik salınımlarını ile büyük olasılıkla önemli anlayışlar düzenleyici makine ve fonksiyonları sağlar tek hücreli kararlılık analizi için sağlar saat.
Introduction
Sitoplazmik özleri Xenopus laevis yumurtadan hazırlanan hücre döngüsü, yumurta, Hızlı hücre döngüsü ilerleme ve başlamaktan yeteneğine büyük miktarda verilen biyokimyasal çalışma için en baskın modellerinden birini temsil mitotik olaylar vitro1,2. Derleme ve kromozom ayrımı1 de dahil olmak üzere aşağı akım mitotik işlemlerin yanı sıra faktör (MPF) olgunlaşma teşvik iğ gibi bu sistemi ilk keşif ve mekanik temel hücre döngüsü düzenleyiciler karakterizasyonu izin verdi ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus yumurta özleri da çalışmalar DNA hasarı ve hücre döngüsü saat8,12,13,14 düzenleyici ağların ayrıntılı diseksiyon için kullanılmıştır /Replication denetim noktası15 ve mitotik Milli Meclis denetim noktası16,17,18.
Hücre döngüsü Xenopus yumurta özleri kullanarak bu çalışmaları esas olarak toplu ölçümler dayalı olmuştur. Ancak, geleneksel toplu tepki deneyleri değil taklit gerçek hücre davranışları, kendi boyutları ve reaksiyon moleküller hücre altı kayma compartmentalization büyük bir farklılık göz önüne alındığında. Ayrıca, mitotik aktiviteleri toplu ölçümleri hızlı bir şekilde8sönümleme önce döngüleri sınırlı sayıda vererek yatkındır. Bu dezavantajları toplu tepkiler daha fazla karmaşık saat dinamik özellikler ve işlevler anlayışı sağlamak için özü sistem engellemiş. Son yıllarda yapılan çalışmalarda faktör tutuklandı (CSF) Xenopus içine nasıl iğ boyutu tarafından modüle aydınlatmak yardım boyut tanımlı hücre benzeri bölmeleri,19,20 ayıklar boş hücre sitostatik kapsüllenmiş sitoplazmik birim. Ancak, bu vitro sistem mayoz II metafaz sitostatik faktörü1eylem tarafından tutuklandı ve bir sistemi uzun vadeli sürekli salınım tek hücre düzeyinde daha fazla araştırma yapılması hücre döngüsü için gereklidir osilatör.
Hücre döngüsü salınımlarını tek hücreli çözünürlük ile çalışmak için geliştirdiğimiz bir hücre ölçekli, sulandırma ve aynı anda birden çok kendini sürekli mitotik salınım işlemlerinde bireysel microemulsion ölçümü için yüksek üretilen iş sistem damlacıkları. Bu ayrıntılı video protokol için biz Bisiklete binme Xenopus laevis yumurta sitoplazma microemulsions 10’dan 300 µm arasında değişen boyutlarda Kapsüllenen tarafından yapay mitotik salınım sisteminin oluşturulması göstermektedir. Bu sistemde, mitotik salınımlarını kromozom yoğunlaşma ve de-yoğunlaşma, nükleer zarf arıza ve reform ve bozulma ve anafaz yüzeylerde (Örneğin, securin-mCherry bu protokolü) sentezi gibi olduğunu başarılı bir şekilde yeniden düzenlendi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz yüksek üretilen iş yapay hücre sistemi geliştirmek için bir roman yöntemi o olanaklı kılmak içinde vitro sulandırma ve uzun vadeli kendini sürekli hücre döngüsü salınımlarını tek hücre düzeyinde izlenmesine sundu. Bu yöntem başarılı yapmak birkaç kritik adım vardır. İyi bir kalite ile ilk, taze sıkılmış Xenopus yumurta koydu yumurta ile karşılaştırıldığında, özleri ile uzun süreli salınım etkinliğini üretmek eğilimindedir. İkinci olarak, kapsülleme …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Madeleine Lu securin mCherry plazmid, kucak adam Lee, Kenneth Ho ve Allen P Liu damlacık üretimi hakkında tartışmalar için Jeremy B. Chang ve James E. Ferrell Jr GFP NLS oluşturmak sağlamak için inşa için teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (erken kariyer Grant #1553031), Ulusal Sağlık Enstitüleri (MIRA #GM119688) ve Sloan araştırma bursu.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
Referências
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
