Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus
Summary
Nós apresentamos um método para a geração de em vitro auto-sustentado mitótica oscilações no nível de célula única encapsulando extratos de ovos de Xenopus laevis em microemulsões de água em óleo.
Abstract
Medição em tempo real das oscilações no nível de célula única é importante para desvendar os mecanismos de relógios biológicos. Apesar de extratos em massa preparados a partir de ovos de Xenopus laevis foram poderosos em dissecando redes bioquímicas subjacentes a progressão do ciclo celular, sua medida média ensemble normalmente leva a uma oscilação amortecida, apesar de cada um oscilador individual sendo sustentada. Isto é devido à dificuldade de sincronização perfeita entre os osciladores individuais em sistemas biológicos barulhentos. Para recuperar a dinâmica de célula única do oscilador, desenvolvemos um sistema de célula artificial baseada em gotículas que pode reconstituir ciclos mitóticos em compartimentos de célula, como encapsular ciclismo citoplasmáticos extratos de ovos de Xenopus laevis . Essas células somente citoplasmática simples apresentam oscilações sustentadas por mais de 30 ciclos. Para construir mais complicadas células com núcleos, nós adicionamos demembranated cromatina de espermatozoides para acionar núcleos auto-montagem no sistema. Observamos uma progressão periódica de cromossomo condensação/ocorre descondensação e núcleos envolvem avaria/reforma, como nas células reais. Isso indica que o oscilador mitótico fielmente as funções para conduzir vários eventos mitóticos a jusante. Seguimos simultaneamente a dinâmica do oscilador mitótico e processos a jusante em gotículas individuais usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo de multi-canal. O sistema de ciclo celular artificial fornece uma estrutura de alto rendimento para manipulação quantitativa e análise das oscilações mitóticas com resolução de célula única, que provavelmente fornece insights importantes sobre as máquinas reguladoras e funções de o relógio.
Introduction
Citoplasmáticos extratos preparados a partir de ovos de Xenopus laevis representam um dos modelos mais predominantes para o estudo bioquímico da célula ciclos, dado o grande volume de oócitos, a progressão do ciclo celular rápido e a capacidade de reconstituir eventos mitótica em vitro1,2. Este sistema permitiu a descoberta inicial e caracterização mecanicista dos reguladores do ciclo celular essencial como fator de promoção da maturação (MPF), bem como a jusante processos mitóticos incluindo eixo montagem e cromossomo segregação1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Os extratos de ovos de Xenopus também têm sido utilizados para dissecação pormenorizada das redes reguladoras do ciclo celular relógio8,12,13,14 e para estudos sobre os danos do DNA /Replication posto15 e o fuso mitótico montagem de ponto de verificação16,17,18.
Estes estudos dos ciclos de célula usando os extratos de ovos de Xenopus foram baseados principalmente em medições de volume. No entanto, os ensaios de reação em massa convencional não podem imitar comportamentos de célula real, dados uma grande discrepância em suas dimensões e subcellular compartimentalização espacial das moléculas de reação. Além disso, medições de volume de actividade mitótica são propensas a dar um número limitado de ciclos antes rapidamente de amortecimento8. Estas desvantagens de reações em massa impediram que o sistema de extrato para fornecer mais compreensão do complexo relógio dinâmico Propriedades e funções. Estudos recentes têm encapsulado sem célula citostáticos (CSF) de fator-preso Xenopus extrai19,20 em compartimentos celulares, como definido pelo tamanho, que ajudaram a elucidar como o tamanho do eixo é modulado pelo volume citoplasmático. No entanto, este sistema em vitro é preso em metáfase da meiose II pela ação do fator citostáticos1, e é necessário um sistema capaz de oscilações sustentadas a longo prazo a nível de célula única para posterior investigação do ciclo celular oscilador.
Para estudar as oscilações do ciclo celular com resolução de célula única, nós desenvolvemos um sistema de alta produtividade para reconstituição e medição simultânea de vários processos mitóticos auto-sustentado oscilatórios em microemulsão individual, célula-escala gotas. Neste protocolo vídeo detalhado, demonstramos a criação do sistema de oscilação mitótica artificial encapsulando ciclismo Xenopus laevis citoplasma de ovo em microemulsões de tamanhos que variam de 10 a 300 µm. Neste sistema, foram mitóticas oscilações incluindo condensação cromossomo e de condensação, colapso do envelope nuclear e reforma e a degradação e síntese de substratos anáfase (por exemplo, securin-mCherry neste protocolo) reconstituído com êxito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos um novo método para o desenvolvimento de um sistema de célula artificial de alto rendimento que permite em vitro reconstituição e acompanhamento a longo prazo do ciclo celular auto-sustentado oscilações no nível de célula única. Existem várias etapas críticas que fazem este método bem sucedido. Ovos de Xenopus espremidos, primeiros com uma boa qualidade, em comparação com ovos estabelecidos, tendem a produzir extratos com atividade de oscilação mais longer-lasting. Em s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Madeleine Lu para a construção do plasmídeo securin-mCherry, colo homem Lee, Kenneth Ho e Allen P Liu para discussões sobre a geração de gotículas, Jeremy B. Chang e James E. Ferrell Jr para a prestação de QUE GFP-NLS construir. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (início de carreira Grant #1553031), o National Institutes of Health (MIRA #GM119688) e uma bolsa de pesquisa do Sloan.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
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