एक शुद्ध मोल्ड-पाड़ मुक्त तीन आयामी कार्डियक ऊतक निर्माण की विधि आधारित
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक शुद्ध मोल्ड आधारित विधि के लिए तीन आयामी पाड़-संतोषजनक संरचनात्मक अखंडता और तुल्यकालिक पिटाई व्यवहार के साथ मुक्त कार्डियक ऊतकों बनाने के लिए ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक उपंयास और आसान शुद्ध मोल्ड-विधि आधारित तीन आयामी (3-डी) अतिरिक्त पाड़ सामग्री के बिना हृदय के ऊतकों बनाने के लिए । मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन cardiomyocytes (iPSC-सीएमएस), मानव कार्डियक fibroblasts (HCFs), और मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) अलग कर रहे है और ७०% iPSC-सीएमएस, 15% HCFs, और 15% HUVECs के साथ एक सेल निलंबन उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया । वे सह रहे है एक अल्ट्रा कम लगाव “फांसी ड्रॉप” प्रणाली है, जो एक समय में spheroids के सैकड़ों संघनित्र के लिए micropores शामिल में संस्कृति । कोशिकाओं को समग्र और अनायास सह के 3 दिनों के बाद spheroids पिटाई के रूप में संस्कृति । spheroids काटा, एक उपंयास मोल्ड गुहा में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और मशीन में एक शेखर पर संस्कृति । spheroids एक परिपक्व कार्यात्मक ऊतक लगभग 7 दिनों के बोने के बाद हो जाते हैं । परिणामी multilayered ऊतकों संतोषजनक संरचनात्मक अखंडता और तुल्यकालिक पिटाई व्यवहार के साथ जुड़े spheroids से मिलकर बनता है । इस नई विधि एक reproducible और लागत प्रभावी विधि के रूप में भविष्य में दिल की विफलता के उपचार के लिए इंजीनियर ऊतक बनाने के लिए क्षमता का वादा किया है ।
Introduction
वर्तमान कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग के लक्ष्य के लिए एक चिकित्सा की जगह या संरचना और घायल रोधगलन1के समारोह की मरंमत के लिए विकसित करने के लिए है । 3-डी कार्डियक टिशू मॉडल बनाने के तरीके मूल कार्डियक ऊतक के महत्वपूर्ण सिकुड़ा और electrophysiological गुणों का प्रदर्शन तेजी से2,3का विस्तार किया गया है । रणनीतियों की एक किस्म का पता लगाया गया है और अध्ययन में इस्तेमाल किया4,5। इन तरीकों में विशिष्ट सिंथेटिक और प्राकृतिक जैव सक्रिय hydrogels के उपयोग से लेकर, जैसे जिलेटिन, कोलेजन, फाइब्रिन, और पेप्टाइड्स6, बायो-इंक साठा टेक्नोलॉजीज2 और प्रिंटिंग टेक्नोलॉजीज7.
यह दिखाया गया है कि पाड़ मुक्त तरीकों के रूप में तुलनीय ऊतकों का उत्पादन कर सकते है भौतिक आधारित तरीकों, विदेशी मचान सामग्री8शामिल की कमियां के बिना । Oren Caspi एट अल. प्रदर्शन किया है कि कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के शामिल उच्च संवहनी मानव इंजीनियर कार्डियक ऊतक9की पीढ़ी में सक्षम बनाता है । चिन एट अल. spheroids से कार्डियक पैच निर्माण के लिए एक 3-डी मुद्रण पद्धति विकसित की है । परिणामस्वरूप पैच एक 70:15:15 अनुपात10में cardiomyocytes, fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं से बना रहे हैं । Spheroids के लिए प्रभावी हो दिखाया गया है “निर्माण ब्लॉक” पाड़ के मुक्त कार्डियक ऊतक निर्माण, के रूप में वे हाइपोक्सिया के खिलाफ प्रतिरोधी रहे है और प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त यांत्रिक अखंडता के अधिकारी11,12। पिछले अध्ययनों से अंडाकार आकृति निर्माण के लिए कई निर्माण विधियों का प्रदर्शन किया है, फांसी छोड़ विधि के उपयोग सहित, स्पिनर कुप्पी13, microfluidic सिस्टम14, और गैर-अनुयाई संस्कृति बिना कोट या लेपित सतहों agarose माइक्रो मोल्ड्स15. इस प्रोटोकॉल में, हम हैंगिंग ड्रॉप डिवाइस का उपयोग करते हैं, जिसमें एक समय में सैकड़ों spheroids के लिए micropores होते हैं ।
यह अध्ययन एक उपंयास और कुशल पाड़ कार्डियक ऊतक निर्माण, जो मैंयुअल रूप से एक वर्ग मोल्ड गुहा में spheroids बोने और परिपक्वता के लिए एक शेखर पर ऊतक मशीन शामिल करने के लिए मुक्त विधि प्रस्तुत करता है । हमेशा की तरह स्थिर संस्कृति की स्थिति के तहत, ऑक्सीजन प्रसार ऊतक निर्माण के बाहरी पहलुओं के लिए सीमित है, केंद्रीय परिगलन में जिसके परिणामस्वरूप । हालांकि, नेट मोल्ड के साथ, सभी spheroids मोल्ड में वरीयता प्राप्त एक निरंतर द्रव गति के साथ मीडिया में डूबे हुए हैं, पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की वृद्धि प्रसार के लिए अनुमति दी । इसके अतिरिक्त, इस सांचे में ढालना आधारित विधि अलग के एक साथ निर्माण के लिए अनुमति देता है-ंयूनतम मैनुअल प्रयास के साथ ऊतक पैच आकार और परिणामी ऊतक आसानी से मोल्ड से हटाया जा सकता है । इस उपंयास विधि पाड़ मुक्त, multilayered कार्डियक पैच के कुशल और reproducible निर्माण के लिए अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि का महत्व इसके reproducibility और परिणामी multilayered कार्डियक ऊतक की प्रभावशीलता में निहित है । कार्डिएक ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में, मौजूदा लक्ष्यों में से एक को धड़क रहा है, multilayered, और कार्यात्मक 3 डी कार्डिय?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक निंनलिखित धन स्रोत: जादू है कि हृदय अनुसंधान के लिए कोष मामलों स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
Referências
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).
- Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).
- Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
- Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).
- Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163 (2016).
- Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).
- Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7 (1), 4566 (2017).
- Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
- Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
- Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).
- Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
- Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).
- Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
- Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).
- Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
- Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
- Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).
