Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine net Schimmel basierende Methode um dreidimensionale Gerüst-freie kardialen Gewebe mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten zu erstellen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige und einfache net Schimmel-basierte Methode, dreidimensionale (3D) kardialen Gewebe ohne zusätzliche Gerüst-Material. Human-induzierte pluripotente Stammzellen-Zelle abgeleitet Kardiomyozyten (iPSC-CMs), menschliche kardialen Fibroblasten (TREIBGASEN) und menschliche nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) zu isolieren und verwendet, um eine Zellsuspension mit 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel generieren. Sie sind in eine extrem niedrige Befestigungssystem “hängenden Tropfen”, die Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert enthält Co kultiviert. Die Zellen aggregieren und spontan schlagende Sphäroide nach 3 Tagen der kokultur bilden. Die Sphäroide werden geerntet, in einen Roman Formhohlraum entkernt und auf einen Shaker im Brutschrank kultiviert. Die Sphäroide werden Reife Funktionsgewebe ca. 7 Tage nach der Aussaat. Die daraus resultierende mehrschichtige Gewebe bestehen aus verschmolzenen Sphäroide mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten. Diese neue Methode hat viel versprechende Potenzial als eine reproduzierbare und kostengünstige Methode, um technische Gewebe für die Behandlung der Herzinsuffizienz in der Zukunft zu schaffen.
Introduction
Das Ziel des aktuellen Herzgewebe Engineering ist, eine Therapie zu ersetzen oder zu reparieren, die Struktur und Funktion des verletzten Herzmuskelgewebe1zu entwickeln. Methoden zum Erstellen von 3-d-Herzgewebe Modelle präsentiert die wichtigeren kontraktilen und elektrophysiologischen Eigenschaften des nativen Herzgewebe haben2,3rasch ausgedehnt. Eine Vielzahl von Strategien haben erforscht und in Studien4,5verwendet worden. Diese Methoden reichen von den Einsatz von speziellen synthetischen und natürlichen bioaktiven Hydrogele, wie Gelatine, Kollagen, Fibrin und Peptide6, auf Bio-Tinte Ablagerung Technologien2 und Bioprinting Technologien7.
Es hat sich gezeigt, dass Gerüst-freie Methoden als Biomaterial-basierte Methoden, ohne die Nachteile der Einbeziehung ausländischer Gerüst Material8vergleichbare Gewebe produzieren können. Oren Caspi Et Al. zeigten, dass die Einbeziehung der verschiedenen Arten von Zellen die Generation stark vaskularisierte menschlichen entwickelt Herzgewebe9ermöglicht. Kinn Et Al. entwickelt eine 3-d-Druckverfahren für kardiale Patch Kreation aus Sphäroide. Daraus resultierende Patches bestehen aus Herzzellen, Fibroblasten und Endothelzellen in einem 70:15:15 Verhältnis10. Sphäroide nachweislich wirksame “Bausteine” der Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung, wie sie sind resistent gegen Hypoxie und verfügen über ausreichende mechanische Integrität für Implantation11,12. Frühere Studien haben gezeigt, verschiedene Herstellungsmethoden für Sphäroid Schöpfung, einschließlich der Verwendungdes der hängenden drop-Methode, Spinner Fläschchen13, mikrofluidische Systeme14und nicht anhaftende Kultur Oberflächen unbeschichtet oder beschichtet mit Agarose Mikro-Gußformen15. In diesem Protokoll verwenden wir die hängenden Tropfen Gerät, enthält Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert.
Diese Studie stellt eine neuartige und effiziente Gerüst-freie Methode für Herzgewebe Erstellung, manuell die Sphäroide in einen quadratischen Formhohlraum Aussaat und Inkubation des Gewebes auf einen Shaker für Reifung. Unter üblichen statischen Kulturbedingungen ist Sauerstoffdiffusion beschränkt sich auf die äußeren Aspekte der Gewebe-Konstrukt, was zentrale Nekrose. Mit der net Form Tauchen alle Sphäroide ausgesät in die Form jedoch in Medien mit einer Konstanten fluidische Bewegung, so dass für die verstärkte Verbreitung von Nährstoffen und Sauerstoff. Darüber hinaus diese Form-basierte Methode ermöglicht die gleichzeitige Erstellung von unterschiedlich großen Gewebe Patches mit minimalem manuellen Aufwand und das resultierende Gewebe kann leicht aus der Form entfernt werden. Diese neuartige Methode ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Erstellung von Gerüst-frei, vielschichtigen kardiale Patches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bedeutung dieser Methode liegt in ihrer Reproduzierbarkeit und die Wirksamkeit der daraus resultierenden vielschichtigen Herzgewebe. Im Bereich der kardialen Gewebetechnik ist eines der aktuellen Ziele zu identifizieren, eine Methode um schlagen, vielschichtig und funktionale 3-d-kardiale Patches zu konstruieren. Wir berichten über eine effiziente und reproduzierbare Methode vielschichtigen kardialen Gewebe durch manuelle Direktsaat der Sphäroide bestehend aus Herzzellen, Endothelzellen und Fibroblasten in eine neu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen die folgende Finanzierungsquelle: Magie, dass Angelegenheiten Fonds für Herz-Kreislauf-Forschung.
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
Referências
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