Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco
Summary
Questo protocollo descrive un metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci senza impalcatura tridimensionale con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio.
Abstract
Questo protocollo descrive un romanzo e facile metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci di tridimensionale (3D) senza materiale aggiuntivo impalcatura. Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC-CMs), fibroblasti cardiaci umani (HCF) e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) sono isolate e utilizzate per generare una sospensione cellulare con 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs. Sono co-coltivate in un sistema di “appendere goccia” attacco ultra-basso, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta. Le cellule di aggregazione e spontaneamente formano sferoidi pestaggio dopo 3 giorni di co-coltura. Sferoidi sono raccolte, seminati in una cavità dello stampo novello e coltivate su un agitatore in incubatrice. Sferoidi diventano un tessuto funzionale maturo circa 7 giorni dopo la semina. I tessuti multistrati risultanti è costituito da sferoidi fusi con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio. Questo nuovo metodo ha un potenziale promettente come un metodo riproducibile ed economico per creare tessuti ingegnerizzati per il trattamento dello scompenso cardiaco in futuro.
Introduction
L’obiettivo di ingegneria del tessuto cardiaco attuale è quello di sviluppare una terapia per sostituire o riparare la struttura e la funzione del tessuto del miocardio danneggiato1. Metodi per creare modelli 3D del tessuto cardiaco che esibiscono le importanti proprietà contrattili ed elettrofisiologiche del tessuto cardiaco nativo sono stati rapidamente in espansione2,3. Una varietà di strategie sono stati esplorati e utilizzati in studi4,5. Questi vanno di metodi dall’uso di specifici idrogeli bioattivi naturali e sintetici, come gelatina, collagene, fibrina e peptidi6, a bio-inchiostro deposizione tecnologie2 e multimateriali tecnologie7.
È stato dimostrato che senza impalcatura metodi possono produrre tessuti paragonabile come metodi basati su biomateriale, senza gli svantaggi di incorporare ponteggi stranieri materiale8. Oren Caspi et al hanno dimostrato che l’incorporazione di vari tipi di cellule consente la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano altamente vascularized9. Mento et al ha sviluppato un metodo di stampa 3D per la creazione di patch cardiaci di sferoidi. Le patch risultante sono composte di cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali in un rapporto di 70:15:1510. Sferoidi sono stati indicati per essere efficaci “building blocks” della creazione del tessuto cardiaco senza impalcatura, come essi sono resistenti contro ipossia e possedere sufficiente integrità meccanica per l’impianto11,12. Gli studi precedenti hanno dimostrato parecchi metodi di fabbricazione per la creazione di sferoide, compreso l’uso dell’impiccagione drop metodo, spinner boccette13, di sistemi microfluidici14e antiaderente cultura superfici non rivestite o rivestite con agarosio micro-stampi15. In questo protocollo, usiamo l’impiccagione dispositivo di discesa, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta.
Questo studio presenta un romanzo e l’efficiente metodo senza impalcatura per la creazione di tessuto cardiaco, che comprende il seeding manualmente sferoidi in una cavità dello stampo quadrato e incubando il tessuto su un agitatore per maturazione. In condizioni di coltura statica usuale, diffusione dell’ossigeno è limitato agli aspetti esterni del costrutto del tessuto, con conseguente necrosi centrale. Tuttavia, con la muffa netta, tutte le sferoidi seminati nello stampo sono immersi nei media con un costante movimento fluidico, consentendo per la maggiore diffusione di sostanze nutritive e di ossigeno. Inoltre, questo metodo basato su stampo consente la creazione simultanea di patch di tessuto di diverse dimensioni con il minimo sforzo manuale e il tessuto risultante può essere facilmente rimosso dallo stampo. Questo nuovo metodo consente la creazione efficiente e riproducibile di patch cardiache senza impalcatura, multistrata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il significato di questo metodo risiede nella sua riproducibilità e l’efficacia del tessuto cardiaco multistrato risultante. Nel campo dell’ingegneria del tessuto cardiaco, uno degli attuali obiettivi è quello di identificare un metodo per costruire palpitante, multistrata e funzionale 3D patch cardiache. Segnaliamo un metodo efficace e riproducibile di creare tessuti cardiaci multistrati di semina diretta manuale di sferoidi composti di cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti in un romanzo stampo netto. Lo st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono la seguente fonte di finanziamento: il fondo di questioni che magia per ricerca cardiovascolare.
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
Referências
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