JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Dit protocol biedt een methode om vast te stellen gehumaniseerd muizen (hu-NSG) via Intrahepatische injectie van menselijke hematopoietische stamcellen in straling-geconditioneerd neonatale NSG muizen. De hu-NSG muis is gevoelig voor HIV-infectie en combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en dient als een geschikt pathofysiologisch model voor HIV-replicatie en latentie onderzoeken.

Abstract

Ethische regels en technische uitdagingen voor onderzoek in de menselijke pathologie, immunologie en therapeutische ontwikkeling hebben kleine diermodellen geplaatst in hoge vraag. Met een nauwe genetische en gedragsmatige gelijkenis met mensen zijn kleine dieren zoals de muis goede kandidaten voor ziekten bij de mens modellen, waarlangs mens-achtige symptomen en reacties kunnen worden gerecapituleerd. Verder kan de genetische achtergrond van muis aangepast aan uiteenlopende eisen worden gewijzigd. De KNIPOOG/SCID/IL2rγnull (NSG) muis is één van de meest gebruikte immuungecompromitteerde muis spanningen; Hierdoor engraftment met menselijke hematopoietische stamcellen en/of menselijke weefsels en de verdere ontwikkeling van een functionele menselijk immuun systeem. Dit is een kritieke mijlpaal in het begrip van de prognose en pathofysiologie van mens-specifieke ziekten zoals HIV/AIDS en medeplichtigheid aan het zoeken naar een remedie. Hierin, rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van een gehumaniseerd NSG muismodel (hu-NSG) door hematopoietische stamceltransplantatie in een muis neonatale NSG straling-geconditioneerd. De hu-NSG muismodel toont meerdere lineage ontwikkeling van getransplanteerde menselijke stamcellen en de gevoeligheid voor HIV-1 virale infectie. Het recapituleert ook belangrijke biologische kenmerken in respons op combinatorische antiretrovirale therapie (cART).

Introduction

Omdat de vaststelling van geschikte diermodellen voor ziekten bij de mens is de sleutel tot het vinden van een remedie, hebben passende dieren modellen lang voortgezet en verbeterd na verloop van tijd. Meerdere stammen van immuungecompromitteerde lymfkliertest modellen zijn ontwikkeld die de engraftment van menselijke cellen en/of weefsels en de latere uitvoering van gehumaniseerd functies1,2 toelaten. Dergelijke gehumaniseerd Muismodellen staan kritisch tegenover voor onderzoek van mens-specifieke ziekten3,4,5.

Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) als gevolg van infectie met het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) is een voorbeeld. Voorafgaand aan de vaststelling van gehumaniseerd Muismodellen beperkt ethische en technische beperkingen HIV/AIDS preklinische dierstudies naar niet-menselijke primaten3. Echter, de hoge kosten en vereisten voor gespecialiseerde zorg voor zo’n dier een belemmering vormen voor HIV/AIDS studies in typische academische instellingen. HIV voornamelijk infecteert menselijke CD4 + T-cellen en impact van de ontwikkeling en de immuunrespons van andere menselijke immune cellen zoals B-cellen, macrofagen en dendritische cellen6; kleine dierlijke modellen met een functionele menselijk immuunsysteem getransplanteerd zijn daarom in hoge vraag.

Een doorbraak kwam in 1988, toen CB17 –scid muizen met een mutatie Prkdcscid ontwikkeld en succesvolle engraftment van het menselijke immuunsysteem1toonde. De resultaten van de mutatie Prkdcscid in defecte T – en B-cel-functies en een ablated adaptieve immuunsysteem in muizen, waardoor de engraftment van menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), hematopoietische stamcellen (HSCs), en foetale hematopoietische weefsels7,8. Niettemin, lage niveaus van engraftment worden vaak waargenomen bij dit model; mogelijke oorzaken zijn 1) residuele aangeboren immuun activiteit gemoduleerd via natural killer (NK)-cellen en 2) de ontwikkeling van de late-stadium van muis T – en B-cellen (leakiness)5. De verdere ontwikkeling van de nietzwaarlijvige diabetische (NOD)-scid muismodel bereikt dramatische down-regulatie van de activiteit van de NK-cel; het is dus een hoger niveau en meer duurzame engraftment van menselijke immuunsysteem componenten9kunnen steunen. Verder onderdrukken of belemmeren de ontwikkeling van aangeboren immuniteit, Muismodellen truncation of totale knockout van de interleukin-2 receptor γ-keten (Il2rg) rekening houdend met in de (NOD) –scid achtergrond werden opgericht. Il2rg, ook bekend als gemeenschappelijk cytokine-receptor γ-keten, is een onmisbaar onderdeel van verschillende cytokine receptoren10,11,12,13. Stammen zoals de KNIPOOG. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) en NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presenteren robuuste verstoring van muis cytokine signalering en volledige ablatie van NK-cel ontwikkeling, in aanvulling op ernstige aantasting van adaptieve immuniteit14,15,16.

Drie gehumaniseerd muismodellen, rekening houdend met een scid mutatie en Il2rg knock-out in HIV/AIDS-onderzoek vaak werkzaam zijn: de BLT (beenmerg/lever/zwezerik)-model, het model van de PGO (perifere bloed leukocyten) en de SRC (SCID repopulatie cel) model 3. de BLT model is gemaakt via chirurgische transplantatie van menselijke foetale lever en thymus onder de muis nier capsule vergezeld met intraveneuze injectie van foetale lever HSCs3,17,18. De BLT muismodel biedt hoge engraftment werkzaamheid, ontwikkeling van menselijke hematopoietische cellen in alle geslachten, en totstandbrenging van een sterke menselijke immuunsysteem; Daarnaast is T-cellen zijn opgeleid in een menselijke autologe zwezerik en vertonen immuunresponsen HLA-beperkte4,5,17,19. De eis voor chirurgische procedures blijft echter het belangrijkste nadeel van de BLT-model. De muismodel van PGO is opgericht door intraveneuze injectie met menselijke perifere lymfoïde cellen. Het PGO-model biedt gemak en succesvolle T-cel engraftment levert, maar de toepassing ervan is beperkt als gevolg van onvoldoende B-cel en myeloïde cel engraftment, laag engraftment niveau algemene en het ontstaan van ernstige graft – versus – host-ziekte (GVGH)3 ,20. De SRC muismodel is door injectie van menselijke HSCs in pasgeboren of jonge volwassen SCID muizen aangetoond. Het gemiddelde engraftment efficiëntie boven 25% (beoordeeld als perifeer bloed CD45 percentage) vertoont en ondersteunt de ontwikkeling van meerdere-bloedlijn van geïnjecteerd HSCs en het uitwerken van een aangeboren menselijke immuunsysteem. De beperking van het SRC-model is echter dat de T-cel-respons is muis H2-beperkt in plaats van menselijke HLA-beperkte14,21.

De SRC muismodel wordt beschouwd als een model voor facile en betrouwbare voor preklinische HIV/AIDS kleine dierlijke studies, wordt geïllustreerd door het consistent engraftment van een menselijke immuunsysteem en succesvolle hematopoietische ontwikkeling. Wij eerder gemeld van de oprichting van een muismodel NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) en de toepassing ervan in de HIV-replicatie en latentie studies22,23,24beschreven. Deze hu-NSG muismodel vertoont hoge niveaus van beenmerg homing, gevoeligheid voor HIV-infectie, en de recapitulatie van HIV-infectie en pathogenese. Bovendien, de hu-NSG muismodel correct reageert op combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en recapituleert de virale rebound plasma bij kar geldopname, bevestiging van de oprichting van een HIV latency reservoir25,26 ,27. Dit reservoir van HIV latency wordt verder onderbouwd door overlegging van replicatie-bevoegde HIV virussen ex vivo geïnduceerd door mens rust CD4 + T-cellen van geïnfecteerde en kar-behandeld hu-NSG muizen geïsoleerd.

Hierin beschrijven we de gedetailleerd protocol voor oprichting van de hu-NSG muismodel van neonatale NSG muizen, met inbegrip van de procedures met betrekking tot HIV-infectie en kar behandeling voor latency ontwikkeling. Wij verwachten dat dit protocol te bieden een nieuwe reeks van benaderingen in HIV dierlijke studies met betrekking tot HIV Virologie, latency en behandeling.

Protocol

Alle dierenverzorgers en procedures hebben ondergaan volgens protocollen gecontroleerd en goedgekeurd door de stad van hoop institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) gehouden door de hoofdonderzoeker van dit onderzoek (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Menselijke foetale leverweefsel is verkregen uit geavanceerde Bio-Resources (Alameda, CA), een non-profitorganisatie, overeenstemming met federale en nationale regelgeving. De leverancier heeft zijn eigen institutionele Review Board (IRB) en voldoet aan de eisen i…

Representative Results

Stroom cytometry analyse wordt vaak uitgevoerd om te valideren van de zuiverheid van geïsoleerde HSCs, engraftment niveaus, profiel immuun reacties op virale infectie, evalueren en enquête kar werkzaamheid. Een typische antilichaam deelvenster bevat 4-6 individuele fluorescently gelabelde antilichamen; een cytometer van de stroom met meerdere lasers en een brede selectie van filters is dus cruciaal om accurate resultaten te behalen. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa…

Discussion

Immuungecompromitteerde muizen geaccepteerd met menselijke cellen/weefsels fysiologische kenmerken van mens-achtig aanwezig en een enorme waarde voor immunologie, pathologie en pathofysiologie studies betreffende mens-specifieke ziekten. Onder meerdere muizenstammen immuungecompromitteerde, de knik. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) model is het meest immunodeficiëntie als gevolg van het ontbreken van zowel aangeboren en adaptieve immuniteit, evenals ablated worden muis-specifieke cytokine s…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [J.J.R. verlenen nummers R01AI29329, R01AI42552 en R01HL07470] en het National Cancer Institute van de National Institutes of Health [subsidie nummer P30CA033572 ter ondersteuning van de stad van hoop integratieve Genomics Analytische farmacologie en analytische Cytometry Cores]. De volgende reagens werd verkregen door de NIH AIDS-onderzoek en reagens referentieprogramma, divisie van AIDS, NIAID, NIH: BaL van het HIV-virus.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O’Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van’t Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Tags

Hu-NSG Mouse ModelHIV ReplicationHIV LatencyNon-invasiveHuman Stem CellsCD34+ HSCsNOD/SCID/IL2rγnull MiceCARTHIV InfectionEngraftment ValidationFlow Cytometry
check_url/pt/58255?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image