Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila der erste kodierende Exon Gene durch Transkription Treiber ersetzen. CRISPR/Cas9-basierte Methode stellt eine transaktivator Sequenz der endogenen Verordnung eines Gens ersetzt und somit erleichtert Transctivator Ausdruck ausschließlich im Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Muster.
Abstract
Binäre Transkription Systeme sind genetische Werkzeuge zur Visualisierung und Manipulation Zelle Schicksal und Gen-Ausdruck in spezifischen Gruppen von Zellen oder Geweben in Modellorganismen weit verbreitet. Diese Systeme enthalten zwei Komponenten als separate transgene Linien. Eine Treiber-Linie drückt eine transcriptional Aktivator unter der Kontrolle der gewebespezifische Promotoren/Enhancer und ein Reporter/Effektor Linie Häfen ein Zielgen flussabwärts die Bindungsstelle des Aktivators Transkription platziert. Tiere beherbergen beide Komponenten induzieren gewebespezifischen werden von einem Ziel-Genexpression. Präzisen raumzeitlichen Expression des Gens in gezielte Geweben ist entscheidend für unvoreingenommene Auslegung der Zelle/Genaktivität. Daher ist es wichtig, ein Verfahren zur Erzeugung von exklusiven Zelle/Gewebe-spezifische Treiber Linien zu entwickeln. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, um Gewebe hochspezifische gezielte Expressionssystems erzeugen durch den Einsatz einer “gruppierten regelmäßig Interspaced kurze palindromische Repeat/CRISPR-assoziierte” (CRISPR/Cas)-Genom Bearbeitung Technik basiert. Bei dieser Methode die Endonuklease, die Cas9 durch zwei Chimären ausgerichtet ist guide RNAs (gRNA) auf bestimmte Websites im ersten kodierenden Exon eines Gens im Genom Drosophila Doppel-strangbrüchen (DSB) zu erstellen. Anschließend ermöglicht die Verwendung eine exogene Spender Plasmid mit dem transaktivator-Sequenz, die Zelle-autonome Reparatur-Mechanismus unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) des DSB, was präzise löschen und durch die transaktivator zu ersetzen das exon Sequenz. Klopfte in transaktivator äußert sich ausschließlich in den Zellen wo der Cis-regulatorische Elemente des Gens ersetzt sind funktionsfähig. Das detaillierte Schritt für Schritt Protokoll hier vorgestellten zur Erzeugung von binären transkriptionelle Fahrer ausgedrückt in Drosophila Fgf/astlosen-produzierenden epithelialen/neuronalen Zellen für jedes Gen oder gewebespezifische Ausdruck angenommen werden kann.
Introduction
Die genetische Toolbox für gezielte Genexpression wurde gut in Drosophila, so dass es eines der besten Modellsysteme, die Funktion von Genen, die in einer Vielzahl zellulärer Prozesse zu untersuchen. Binäre Expressionssysteme wie Hefe Gal4/UAS (upstream Aktivierung Sequenz), wurde zuerst angenommen, für gewebespezifischen Enhancer Trapping und gen Misexpression in Drosophila genetischen Modell1 (Abbildung 1). Dieses System erleichtert die Entwicklung einer Vielzahl von Techniken wie räumlich-zeitliche Regelung der Überexpression des Gens, Misexpression, ko in ausgewählten Gruppen von Zellen als auch in Zelle Ablation, Zelle markieren, live Verfolgung der zellulären und molekularen Prozesse im Embryo und Gewebe, Linie nachzeichnen und Mosaik Analysen während der Entwicklung. Eine Reihe von binären Transkription System, z. B. bakterielle LexA/LexAOp -System (Abbildung 1) und Neurospora Q-System, sind genetische Werkzeuge, die jetzt häufig in Drosophila, zusätzlich zu das ursprüngliche Gal4/UAS-System für gezielte Gen Ausdruck1,2,3.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode um hochzuverlässige gewebespezifischen binäre Expressionssystems zu erzeugen, durch den Einsatz einer Genom-Bearbeitung Technik. Die jüngsten Fortschritte in der CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung Technologie konnten nie da gewesene Möglichkeiten gerichtete Genom Änderungen in einer Vielzahl von Organismen. Im Vergleich zu den anderen verfügbaren Genom Schnitttechniken, ist das CRISPR/Cas9-System Kostengünstig, effizient und zuverlässig. Diese Technologie nutzt Komponenten des adaptiven Immunsystems bakterielle: ein Cas9 Endonuklease Streptococcus Pyogenes , die eine Doppel-Strang-Pause (DSB) erstellt und eine Chimäre Reiseführer RNA (gRNA), der die Cas9 führt zu einer bestimmten Genom-Website für gezielte DSB4. Die Zellen enthalten die Maschinen um die DSB über verschiedene Wege zu reparieren. Nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) führt zu kleinen Einfügungen oder Löschungen Genfunktion, zu stören, während unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) einen definierten gerichtet/wünschenswert genomischen Knock-in/Knock-out führt durch eine exogene HDR-Spender als Vorlage verwenden. Die HDR-basierte Strategie kann effizient genutzt werden, um eine äußerst zuverlässige gewebespezifischen binärer Ausdruck System zu erzeugen, die die Grenzen der traditionellen Enhancer-Trap-Methoden überwinden können. Wir beschreiben eine schrittweise Anleitung zur Nutzung der CRISPR/Cas9-basierte HDR Reparatur bei der Erzeugung einer binären Transkription Treiber-Linie, die unter der Kontrolle der endogenen transkriptionellen und posttranskriptionelle Verordnung von einem Drosophila ausgedrückt wird gen. In diesem Protokoll zeigen wir die Generation einer Fahrer-Linie speziell für astlosen (Bnl) Gen Kodierung eine Familie FGF-Protein, das verzweigte Morphogenese von trachealen Atemwege Epithel5regelt. In diesem Beispiel das erste kodierende Exon des Gens Bnl wurde ersetzt durch die Folge einer bakteriellen LexA transaktivator Sequenz unbeschadet einer endogenen Cis-regulatorischen Sequenzen des Bnl -Gens. Wir zeigen, dass die Strategie eine Bnl-LexA Fahrer Linie erzeugt, die raumzeitlich den Ausdruck ein Reportergen platziert hinter der LexAoperator (LexAop oder LexO) ausschließlich in Bnl steuert- mit dem Ausdruck epitheliale/Mesenchymale/neuronalen Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traditionell wurden Drosophila Enhancer fallen durch zwei unterschiedliche Methoden erzeugt. Eine der Möglichkeiten umfasst zufällige Einfügung eines Treibers (zB., Gal4) Sequenz des Genoms durch Umsetzung (zB., P-Element Umsetzung)1 . Alternativ können die Fahrer Sequenzen transkriptionelle einer vermeintlichen Enhancer/Promotor-Region in ein Plasmid-Konstrukt, unterstellt werden, die dann in eine ektopische Website des Genoms3,<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. F. Port, Dr. K. O’Connor-Giles und Dr. S. Feng für Diskussionen über CRISPR-Strategie; Dr. T.B. Kornberg und Bloomington Stock Center für Reagenzien; UMD bildgebenden zentrale Einrichtung; und die Finanzierung von NIH: R00HL114867 und R35GM124878, SR.
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologia Molecular |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologia Molecular |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologia Molecular |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologia Molecular |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Biologia Molecular |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Biologia Molecular |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Biologia Molecular |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologia Molecular |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologia Molecular |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Biologia Molecular |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Biologia Molecular | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Biologia Molecular |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Biologia Molecular |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
Referências
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