En effektiv strategi for å generere vev-spesifikke binære transkripsjon systemer i Drosophila av genomet redigering
Summary
Her presenterer vi en metode for å generere vev-spesifikke binære transkripsjon systemer i Drosophila ved å erstatte den første koding ekson av gener med transkripsjon drivere. Metoden CRISPR/Cas9-baserte steder en transactivator sekvens under endogene regulering av et erstattet gen, og dermed muliggjør transctivator uttrykk i genet-spesifikke spatiotemporal mønstre.
Abstract
Binær transkripsjon systemer er kraftige genetisk verktøy brukte for å visualisere og manipulere celle skjebne og gene uttrykk i bestemte grupper av celler eller vev i modellen organismer. Disse systemene inneholder to komponenter som separate transgene linjer. En driver linje uttrykker en transcriptional aktivator under kontroll av vev-spesifikke arrangører/enhancers og en reporter/effektor linje havner et mål gen plassert nedstrøms til binding området av transkripsjon aktivatoren. Dyr skjule begge komponentene indusere vev-spesifikke transactivation av et mål genuttrykk. Presis spatiotemporal uttrykk av genet målrettet vev er avgjørende for upartiske tolkning av cellen/gen aktivitet. Derfor er det viktig å utvikle en metode for å generere eksklusive cellen/vev-spesifikk driver linjer. Her presenterer vi en metode for å generere svært vev-spesifikk målrettet uttrykk systemet ved hjelp av en “gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjenta/CRISPR-forbundet” (CRISPR/Cas)-basert genomet redigering teknikk. I denne metoden endonuclease Cas9 er rettet med to chimeric guide RNAs (gRNA) til bestemte nettsteder i de første koding ekson med et i Drosophila genomet opprette dobbel-strand bryter (DSB). Deretter muliggjør bruker en eksogene donor plasmider som inneholder den transactivator sekvensen, celle autonome reparasjon maskiner homologi-rettet reparasjon (HDR) av DSB, presis sletting og utskifting av ekson med transactivator sekvens. Banket i transactivator er uttrykt i celler der cis-regulatoriske elementer erstattet genet er funksjonelle. Detaljerte trinnvise protokollen presenteres her for å generere en binær transcriptional driver uttrykt i Drosophila fgf/branchless-produserende epithelial/neuronal celler kan brukes for alle gen – eller vev-spesifikke uttrykk.
Introduction
Genetisk verktøykassen for målrettet genuttrykk er godt utviklet i Drosophila, en av de beste modell systemene å undersøke funksjonen i gener involvert i en rekke cellulære prosesser. Binær uttrykk systemer, som gjær Gal4/UAS (oppstrøms aktivisering sekvens), ble først vedtatt for vev-spesifikke enhancer fangst og gene misexpression i Drosophila genetisk modell1 (figur 1). Dette systemet tilrettelagt utviklingen av en rekke teknikker som spatiotemporal regulering av gene overuttrykte, misexpression, knockout i valgte grupper av celler så vel som i cellen ablasjon, celle merking, live sporing av mobilnettet og molekylære prosesser i fosteret og vev, avstamning sporing og mosaikk analyser under utvikling. En rekke binære transkripsjon systemet, for eksempel den bakterielle Meglos/Meglosop systemet (figur 1) og Neurospora Q-system, er kraftig genetisk verktøy som er nå mye brukt i Drosophila, i tillegg til den opprinnelige Gal4/UAS systemet for målrettet gene expression1,2,3.
Her presenterer vi en metode for å generere svært pålitelig vev-spesifikke binære uttrykk systemet ved hjelp av en teknikk som genomet-redigering. Den nylige fremskritt innen CRISPR/Cas9 genomet redigering teknologi har tillatt enestående muligheter til å gjøre regissert genom endringene i et bredt spekter av organismer. Sammenlignet med de andre tilgjengelige genom redigering teknikkene, er CRISPR/Cas9 systemet rimelig, effektiv og pålitelig. Denne teknologien benytter komponenter av bakteriell adaptive immunsystemet: en Cas9 endonuclease Streptococcus pyogenes som skaper en dobbel-strand pause (DSB) og en chimeric guide RNA (gRNA), som leder Cas9 til en bestemt genomet nettsted for målrettet DSB4. Cellene inneholder maskiner for å reparere DSB via ulike veier. Non-homologe slutten med (NHEJ) fører til små innsettinger eller slettinger å forstyrre gen funksjon, mens homologi-rettet reparasjon (HDR) introduserer en definert regissert/ønskelig genomisk knock-i/knock-out ved hjelp av en ytre HDR-giver som en mal. Erstatning for HDR-basert strategi kan effektivt brukes til å generere en pålitelig vev-spesifikke binære uttrykk system, som kan overvinne alle begrensningene av tradisjonelle enhancer felle metoder. Vi beskriver en trinnvis fremgangsmåte for utnyttelse av CRISPR/Cas9-baserte HDR reparasjon generere en binær transkripsjon driveren linje som uttrykkes under kontroll av endogene transcriptional og post-transcriptional regulering av en Drosophila gene. Denne protokollen, vi viser generasjonen av driveren linjen gjelder branchless (bnl) genet koding en FGF familie protein som regulerer branching morphogenesis tracheal airway epitel5. I dette første koding ekson av bnl genet ble erstattet av sekvensen av en bakteriell Meglos transactivator rekkefølge uten å endre alle endogene cis-regulatoriske sekvenser av bnl genet. Vi viser at strategien generert en Bnl-Meglos driveren linje som styrer spatiotemporally uttrykk for en reporter genet plassert nedstrøms LexAoperator (LexAop eller LexO) i bnl- uttrykke epithelial/mesenchymal/neuronal celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tradisjonelt ble Drosophila enhancer feller generert av to ulike metoder. En av måtene inkluderer tilfeldige innsetting av en driver (f.eks., Gal4) rekkefølgen genomet av transponering (f.eks., P-element transponering)1 . Alternativt kan driveren sekvensene plasseres under transcriptional kontroll av antatte enhancer/arrangøren regionen i en plasmider konstruksjonen som vil deretter bli integrert i en ektopisk nettsted genomet3,<sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. F. Port, Dr. K. O’Connor-Giles og Dr. S. Feng for diskusjoner om CRISPR strategi; Dr. T.B. Kornberg og Bloomington lager Center for reagenser; UMD tenkelig kjernen fasilitet; og finansiering fra NIH: R00HL114867 og R35GM124878 til SR
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologia Molecular |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologia Molecular |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologia Molecular |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologia Molecular |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Biologia Molecular |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Biologia Molecular |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Biologia Molecular |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologia Molecular |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologia Molecular |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Biologia Molecular |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Biologia Molecular | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Biologia Molecular |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Biologia Molecular |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
Referências
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Biologia do Desenvolvimento. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genética. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genética. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
