एक क्रोमेटिन Immunoprecipitation परख पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में उपंयास NFAT2 लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए
Summary
क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) पश्चिमी दुनिया में सबसे आम ल्यूकेमिया है । NFAT प्रतिलेखन कारकों विकास और कई प्रकार के सेल में सक्रियण के महत्वपूर्ण नियामकों हैं । यहां, हम NFAT2 के उपंयास लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए मानव CLL कोशिकाओं में क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) घातक बी सेल क्लोन के विस्तार की विशेषता है और पश्चिमी देशों में सबसे आम ल्यूकेमिया का प्रतिनिधित्व करता है । CLL रोगियों के बहुमत रोग के एक indolent पाठ्यक्रम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने ल्यूकेमिया कोशिकाओं के एक anergic phenotype, एक बी सेल बाहरी उत्तेजना के लिए अप्रतिसादी रिसेप्टर की चर्चा करते हुए दिखाते हैं । हमें हाल ही में पता चला है कि प्रतिलेखन फैक्टर NFAT2 CLL में anergy का एक महत्वपूर्ण नियामक है । विभिंन रोगों में एक प्रतिलेखन कारक की भूमिका के विश्लेषण में एक प्रमुख चुनौती अपने विशिष्ट लक्ष्य जीन की पहचान है । यह विकारी तंत्र और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के elucidation के लिए बहुत महत्व का है । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) एक क्लासिक के लिए प्रोटीन डीएनए बातचीत और, इसलिए, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों के प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शन तकनीक है । यहां, चिप मानव CLL कोशिकाओं में NFAT2 का सीधा लक्ष्य जीन के रूप में LCK की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । डीएनए और जुड़े प्रोटीन crosslinked formaldehyde का उपयोग कर रहे है और बाद में sonication द्वारा लगभग 200-500 आधार जोड़े (बीपी) के डीएनए टुकड़ों में बाल काटना । पार से जुड़े डीएनए NFAT2 के साथ जुड़े टुकड़े तो चुनिंदा एक αNFAT2 एंटीबॉडी का उपयोग कर सेल मलबे से immunoprecipitated हैं । शुद्धि के बाद, जुड़े डीएनए टुकड़े मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) के माध्यम से पता चला रहे हैं । स्पष्ट संवर्धन के साथ डीएनए अनुक्रम NFAT2 द्वारा vivo मेंलक्षित कर रहे हैं, जो जीनोम के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं । डीएनए की उचित कतरन और आवश्यक एंटीबॉडी के चयन इस विधि के सफल आवेदन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं । इस प्रोटोकॉल लक्ष्य जीन के साथ NFAT2 के प्रत्यक्ष बातचीत के प्रदर्शन के लिए आदर्श है । इसकी प्रमुख सीमा कठिनाई बड़े पैमाने पर बरकरार जीवों में एकाधिक प्रतिलेखन कारकों के लक्ष्य जीन का विश्लेषण परख में चिप को रोजगार है ।
Introduction
क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) पश्चिमी देशों में वयस्कों में सबसे आम ल्यूकेमिया का प्रतिनिधित्व करता है, CD19, CD23 के विशिष्ट संचय का प्रदर्शन, और CD5 परिपक्व बी कोशिकाओं1व्यक्त. अधिकांश रोगियों को एक indolent रोग पाठ्यक्रम है, जो कई वर्षों के लिए विशिष्ट उपचार जरूरत नहीं है प्रदर्शन । इसके विपरीत, कुछ रोगियों तेजी से प्रतिरक्षा के साथ तत्काल चिकित्सीय हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है प्रगति दिखाने के कीमोथेरेपी या अंय लक्षित उपचार2,3। सक्रिय टी कोशिकाओं के नाभिकीय कारक (NFAT) कई कोशिका प्रकार में विभिन्न विकासात्मक और सक्रियण प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले प्रतिलेखन कारकों में से एक परिवार है4,5,6. हम हाल ही में indolent रोग7के साथ रोगियों से CLL कोशिकाओं में NFAT2 के व्यक्त और संवैधानिक सक्रियण का प्रदर्शन किया । यहां, यह बी सेल रिसेप्टर anergy7बुलाया उत्तेजना के लिए एक अप्रतिसादी राज्य को नियंत्रित करता है । यह प्रदर्शित करने के लिए कि NFAT2 बाँध को लिम्फोसाइट-विशिष्ट प्रोटीन tyrosine कळेनासे (LCK) प्रवर्तक और मानव LCK कोशिकाओं में CLL अभिव्यक्ति को विनियमित करता है, एक विशिष्ट क्रोमेटिन immunoprecipitation परख (चिप) विकसित और कार्यरत था.
चिप कई तकनीकों में से एक है जीन अभिव्यक्ति8में प्रतिलेखन कारकों की भूमिका की जांच । जीन अभिव्यक्ति कसकर इस प्रक्रिया9,10,11,12में एक अपूरणीय भाग लेने के प्रतिलेखन कारकों के साथ कई नियामकों द्वारा एक बहुत ही जटिल तरीके से किया जाता है । प्रतिलेखन एक स्थानिक और लौकिक संदर्भ में जीन अभिव्यक्ति विनियमन कारकों कई प्रजातियों में पहचान की गई है (विकास और भेदभाव के लिएजैसे, )13,14,15, 16,17,18. प्रतिलेखन कारकों को शामिल जटिल नियंत्रण तंत्र में त्रुटियाँ कैंसर19,20सहित रोग प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, प्रतिलेखन कारकों की पहचान और उनके संबंधित लक्ष्य उपंयास चिकित्सकीय रास्ते21,22की पेशकश हो सकती है । इस पेचीदा क्षेत्र की जांच करने के लिए कई तरीकों चिप की तरह उपलब्ध हैं, electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA), विभिंन डीएनए पुल नीचे परख और रिपोर्टर-परख8,11,12, 23 , 24.
प्रदर्शित करने के लिए कि एक निश्चित प्रतिलेखन कारक vivo में जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों के साथ सूचना का आदान प्रदान, चिप एक आदर्श तकनीक25है । इस प्रयोजन के लिए, डीएनए और जीवित कोशिकाओं में जुड़े प्रोटीन यूवी विकिरण या formaldehyde (पार से जुड़ा हुआ चिप, XChIP) का उपयोग कर पार कर रहे हैं । यह कदम तथाकथित देशी चिप (NChIP)26में बेहतर डीएनए और प्रोटीन रिकवरी प्राप्त करने के लिए छोड़ा जाता है । डीएनए-प्रोटीन परिसरों बाद sonication द्वारा लगभग 200-500 आधार जोड़े (बीपी) के टुकड़ों में कतरनी और सेल मलबे से immunoprecipitated ब्याज की प्रतिलेखन कारक के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं । जुड़े डीएनए टुकड़े तो शुद्ध और पीसीआर, आणविक क्लोनिंग, और अनुक्रमण द्वारा विशेषता है । वैकल्पिक तकनीक का उपयोग करें microarrays (चिप पर चिप) या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (चिप-Seq) immunoprecipitated डीएनए का विश्लेषण करने के लिए ।
चिप पहले १९८४ में Gilmour और फूल द्वारा शुरू की गई थी जब वे covalently पार से लिंक डीएनए और जीवित जीवाणु27में प्रोटीन बंधे के लिए यूवी प्रकाश का इस्तेमाल किया । कोशिका lysis और बैक्टीरियल आरएनए पोलीमरेज़ के immunoprecipitation पर, ज्ञात जीन की विशिष्ट जांच में vivo वितरण और आरएनए पोलीमरेज़ के घनत्व को मैप करने के लिए उपयोग किया गया । विधि बाद में एक ही जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया था Drosophila28में गर्मी सदमे प्रोटीन जीन पर eukaryotic आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के वितरण का विश्लेषण । XChIP परख और Varshavsky और सहकर्मियों जो पहले formaldehyde पार इस्तेमाल से परिष्कृत किया गया गर्मी सदमे प्रोटीन के साथ हिस्टोन H4 के संघ का अध्ययन जोड़ने के29,30जीन । NChIP दृष्टिकोण है, जो एक बेहतर डीएनए और प्रोटीन की वजह से स्वाभाविक रूप से बरकरार epitopes की वसूली का लाभ वहन करती है और, इसलिए, अधिक से अधिक एंटीबॉडी विशिष्टता, पहले Hebbes और १९८८31में सहयोगियों द्वारा वर्णित किया गया था ।
अंय तकनीकों की तुलना में चिप का लाभ डीएनए का विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन बातचीत वास्तव में है, कि एक प्रतिलेखन कारक की वास्तविक बातचीत vivo में जांच की जा सकती है और कोई जांच या कृत्रिम शर्तों buffers या जैल द्वारा बनाई गई है कार्यरत८,११,१२. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ चिप के संयोजन से, कई लक्ष्यों को एक साथ पहचाना जा सकता है ।
इस तकनीक की प्रमुख सीमाएं हैं25बरकरार जीवों में बड़े पैमाने पर परख करने के लिए सीमित प्रयोज्यता । अंतर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण भी चिप तकनीक का उपयोग कर चुनौतीपूर्ण हो सकता है अगर संबंधित प्रोटीन केवल कम स्तर पर या संकीर्ण समय खिड़कियों के दौरान व्यक्त कर रहे हैं । एक और संभावित सीमित कारक एक उचित एंटीबॉडी की उपलब्धता है चिप11के लिए उपयुक्त ।
चिप प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) द्वारा एक प्रतिलेखन कारक के लक्ष्य जीन की पहचान में vivo के लिए नियोजित किया जा सकता है । विशेष रूप से, लक्ष्य के लिए CLL में NFAT2 के उपंयास लक्ष्य जीन की पहचान थी । चिप क्योंकि अपनी क्षमता के लिए चुना गया था सीधे मानव CLL रोगी कोशिकाओं में प्राकृतिक परिस्थितियों में अलग लक्ष्य जीन के प्रवर्तक क्षेत्रों के लिए NFAT2 के बंधन का प्रदर्शन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सफल चिप परख प्रदर्शन के महत्वपूर्ण कदम एक उपयुक्त एंटीबॉडी और क्रोमेटिन बाल काटना प्रक्रिया25के अनुकूलन का चयन कर रहे हैं । αNFAT2 एंटीबॉडी का चयन इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान विशेष रूप से चु?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम DFG ग्रांट म्यू 3340/1-1 और ड्यूश Krebshilfe ग्रांट ११११३४ (दोनों M.R.M. को संमानित किया) द्वारा समर्थित किया गया था । उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हम एलके Malenke को धन्यवाद देते हैं) ।
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Referências
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