Summary

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Published: December 04, 2018
doi:

Summary

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie in der westlichen Welt. NFAT Transkriptionsfaktoren sind wichtige Regulatoren von Entwicklung und Aktivierung in zahlreichen Zelltypen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) in menschlichen CLL-Zellen, neuartige Zielgene des NFAT2 zu identifizieren.

Abstract

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL) zeichnet sich durch den Ausbau des malignen B-Zell-Klone und stellt die häufigste Leukämie in den westlichen Ländern. Die Mehrheit der CLL-Patienten zeigen eine indolenten Verlauf der Krankheit sowie eines Hauttestes Phänotyp ihrer Leukämie-Zellen unter Bezugnahme auf einen B-Zell-Rezeptor reagiert nicht auf externe Stimulation. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NFAT2 ein entscheidender Regulator der Anergie im CLL. Eine große Herausforderung in der Analyse der Rolle des Transkriptionsfaktors bei verschiedenen Krankheiten ist die Identifikation ihrer spezifischen Zielgene. Dies ist von großer Bedeutung für die Aufklärung der pathogenetische Mechanismen und mögliche therapeutische Interventionen. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine klassische Technik um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu demonstrieren und kann daher verwendet werden, um direkte Zielgene von Transkriptionsfaktoren in Säugetierzellen zu identifizieren. Hier wurde ChIP zur LCK als ein direktes Zielgen des NFAT2 in den menschlichen CLL-Zellen zu identifizieren. DNA und damit verbundenen Proteine sind vernetzt mit Formaldehyd und anschließend durch Ultraschallbehandlung in DNA-Fragmente von ca. 200-500 Basenpaaren (bp) geschoren. Vernetzte DNA-Fragmente, die mit NFAT2 verbunden sind dann selektiv Immunoprecipitated aus Zellenrückstand mit einem αNFAT2 Antikörper. Nach der Reinigung sind damit verbundenen DNA-Fragmente über quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) erkannt. DNA-Sequenzen mit offensichtlich Bereicherung darstellen Regionen des Genoms, die NFAT2 in Vivoausgerichtet sind. Geeigneten Scheren der DNA und die Auswahl der benötigten Antikörper sind besonders wichtig für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode. Dieses Protokoll eignet sich für die Demonstration der direkten Wechselwirkung von NFAT2 mit Zielgene. Seine große Einschränkung ist die Schwierigkeit, ChIP in umfangreichen Tests, die Analyse der Zielgene von mehreren Transkriptionsfaktoren in intakter Organismen zu beschäftigen.

Introduction

Chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie bei Erwachsenen in den westlichen Ländern, präsentiert unterschiedliche Ansammlung von CD19, CD23 und CD51Zellen Reifen B zum Ausdruck zu bringen. Die meisten Patienten zeigen eine träge Krankheitsverlauf, die keine spezifische Behandlung für viele Jahre erforderlich macht. Im Gegensatz dazu zeigen einige Patienten schnelle Progression erfordern sofortige therapeutische Interventionen mit Immun-Chemotherapie oder andere gezielte Therapien2,3. Nuklearer Faktor der aktivierten T-Zellen (NFAT) ist eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die Kontrolle der verschiedenen Entwicklungs- und Aktivierung Prozesse in vielen Zelle Arten4,5,6. Wir bewiesen kürzlich Überexpression und konstitutionelle Aktivierung des NFAT2 in CLL-Zellen von Patienten mit indolenten Krankheit7. Es regelt hier einen nicht interaktiver Status B-Zell-Rezeptor Stimulation Anergie7genannt. Um zu zeigen, dass NFAT2 an den Lymphozyten-spezifische Protein Tyrosin-Kinase (LCK) Veranstalter bindet und LCK Ausdruck in menschlichen CLL-Zellen, eine spezifische Chromatin Immunopräzipitation Assay regelt (ChIP) entwickelt und eingesetzt.

ChIP ist einer der mehrere Techniken, um die Rolle der Transkriptionsfaktoren in gen Ausdruck8zu untersuchen. Genexpression wird fest auf sehr komplexe Weise durch mehrere Regler mit Transkriptionsfaktoren, die unter eine unersetzliche Rolle in diesem Prozess9,10,11,12inszeniert. Transkriptionsfaktoren, die Regulierung der Genexpression in einem räumlichen und zeitlichen Kontext sind in zahlreichen Arten (z. B. für die Entwicklung und Differenzierung)13,14,15identifiziert worden, 16,17,18. Fehler in der komplizierten Kontrollmechanismen mit Transkriptionsfaktoren führen zu einer Vielzahl von pathologischen Prozessen einschließlich Krebs19,20. Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und ihre jeweiligen Ziele könnte daher neue therapeutische Wege21,22bieten. Um dieses faszinierende Gebiet zu untersuchen sind mehrere Methoden verfügbar wie ChIP, elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA), verschiedene DNA-Pulldown-Assays und Reporter-Assays8,11,12, 23 , 24.

Um zu zeigen, dass ein bestimmte Transkriptionsfaktor mit bestimmten Regionen des Genoms Interaktion ist in vivo ChIP eine ideale Technik25. Zu diesem Zweck sind DNA und damit verbundenen Proteine in lebenden Zellen vernetzt mit UV-Bestrahlung oder Formaldehyd (vernetzte ChIP, XChIP). Dieser Schritt entfällt, bessere DNA- und Protein-Erholung in der so genannten native ChIP (NChIP)26zu erhalten. Die DNA-Protein-komplexe werden anschließend durch Ultraschallbehandlung in Fragmente von ca. 200-500 Basenpaaren (bp) und Immunoprecipitated aus der Zellenrückstand mit einem spezifischen Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor von Interesse geschoren. Die damit verbundenen DNA-Fragmente werden dann gereinigt und zeichnet sich durch PCR, molekulare Klonierung und Sequenzierung. Alternative Techniken mittels die Immunoprecipitated DNA analysieren Microarrays (ChIP-on-Chip) oder der Next Generation Sequencing (ChIP-Seq).

ChIP wurde erstmals von Gilmour und Lis 1984 wenn sie UV benutzt Licht auf kovalent Querverbindung DNA und Proteine in lebenden gebunden Bakterien27. Nach lyse der Zelle und Immunopräzipitation der bakteriellen RNA-Polymerase wurden spezifische Sonden bekannten Gene verwendet, um die in-Vivo -Verteilung und Dichte der RNA-Polymerase zuzuordnen. Die Methode wurde anschließend durch die gleichen Untersucher verwendet, um die Verteilung der eukaryotischen RNA-Polymerase II auf Hitze Schock Protein Gene in Drosophila28zu analysieren. XChIP-Assay wurde weiter verfeinert, Varshavsky und Kollegen, die Formaldehyd Vernetzung um die Vereinigung von Histon H4 mit Heat Shock Protein Gene29,30studieren zum ersten Mal verwendet. Der NChIP Ansatz, welcher den Vorteil einer besseren DNA- und Protein Erholung wegen natürlich intakt Epitope trägt und daher größere Antikörperbesonderheit wurde erstmals von Hebbes und Kollegen in 198831beschrieben.

Der Vorteil des Chips im Vergleich zu anderen Techniken, um DNA-Protein Interaktionen zu analysieren ist in der Tat, dass die tatsächliche Interaktion einen Transkriptionsfaktor untersuchten in Vivo und keine Sonden oder künstliche Bedingungen erstellt von Puffer oder Gele sind 8,11,12eingesetzt. Durch die Kombination von ChIP mit Next Generation Sequencing, können mehrere Ziele gleichzeitig identifiziert werden.

Wesentliche Einschränkungen dieser Technik sind seine begrenzte Anwendbarkeit auf groß angelegte Assays in intakter Organismen25. Die Analyse der differentiellen gen Expressionsmuster kann auch anspruchsvolle Techniken ChIP, wenn die jeweiligen Proteine nur in geringen Mengen oder bei engen Zeitfenstern ausgedrückt werden. Ein weiterer potentiell limitierende Faktor ist die Verfügbarkeit eines geeigneten Antikörpers für ChIP11geeignet.

Die hier vorgestellten ChIP-Protokoll kann für die in Vivo -Identifizierung der Zielgene von Transkriptionsfaktor durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) eingesetzt werden. Insbesondere war das Ziel, neuartige Zielgene von NFAT2 in CLL zu identifizieren. ChIP wurde wegen seines Potentials, die Bindung von NFAT2 an den Projektträger Regionen unterschiedliche Zielgene unter natürlichen Bedingungen in den menschlichen Patienten CLL-Zellen direkt unter Beweis stellen.

Protocol

Alle Experimente mit menschlichem Material wurden von der Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigt und schriftliche Einwilligung wurde von allen Patienten, die Proben zu dieser Studie beigetragen haben. 1. Isolierung und Stimulation der Jurkat-Zellen Hinweis: Um das Protokoll zu optimieren, verwenden Sie die Jurkat-Zell-Linie bekannt ist, das hohe Niveau der NFAT2 zum Ausdruck bringen. Alle Schritte werden unter einem Laminar-Flow-Haube ausgeführt. <o…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt eine vorbildlich Flow-Zytometrie-Analyse eines CLL-Patienten nach der Färbung mit CD19-FITC und CD5-PE Antikörper durchgeführt. Abbildung 1a zeigt die Anspritzung von Lymphozyten, vertritt die Mehrheit der Zellen im Blut von Patienten mit CLL. Abbildung 1 b zeigt den Anteil der CD19+/CD5+ CLL-Zellen, die 89.03 % der Lymphozyten in diesem Beispiel darstellen….

Discussion

Die entscheidenden Schritte zur Durchführung einer erfolgreichen ChIP Tests sind die Auswahl eines geeigneten Antikörpers und die Optimierung des Chromatins Scheren Prozess25. Die Auswahl der αNFAT2 Antikörper erwies sich als besondere Herausforderung bei der Entwicklung dieses Protokolls. Zwar gibt es mehrere αNFAT2 Antikörper im Handel erhältlich und der Großteil dieser funktioniert gut für das westliche Beflecken und andere Anwendungen, war Klon 7A6 der einzige Antikörper, welcher fü…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der DFG unterstützt MU 3340/1-1 und der Deutschen Krebshilfe gewähren 111134 (beide an M.R.M. vergeben) zu gewähren. Wir danken Elke Malenke für hervorragende technische Unterstützung).

Materials

1 X PBS Sigma Aldrich D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort Eppendorf 5355 000.011 Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent Thermo Scientific B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer Thermo Scientific B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS Roth 4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer Thermo Scientific B0007
Anti-NFAT2 antibody Alexis 1008505 Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody Cell Signaling 8032S Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade Abcam ab2796 Clone 7A6
big Centrifuge Eppendorf 5804R Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human BD Biosciences 555412 Clone  HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5  BD Biosciences 555353 Clone  UCHT2
Density gradient medium Biocoll  (Density 1,077 g/ml) Merck L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL eppendorf 22431021
FBS superior Merck S0615
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440
iBlot 2 Gel Transfer Device Thermo Scientific IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size Thermo Scientific IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones Diagenode C01010059
Ionomycin calcium salt Sigma Aldrich I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg LI-COR Biosciences 926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg LI-COR Biosciences 925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System LI-COR Biosciences B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche 4729692001 Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution      OptiLyse B Beckman Coulter IM1400
M220 AFA-grade water Covaris 520101
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet Thermo Scientific 12301D Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X Thermo Scientific 11140050
Microscope Axiovert 25 Zeiss 451200 Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm Covaris 520045
Neubauer improved counting chamber Karl Hecht GmbH &            Co KG 40442012 Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette Sarstedt 02.1064
Nuclease-free water Promega P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well Thermo Scientific NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL LI-COR Biosciences 927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X Merck A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quanta Bio 95072-012
PMA Sigma Aldrich P1585
Primer CD40L promotor region forward Sigma Aldrich 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward Sigma Aldrich 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward Sigma Aldrich 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control Cell Signaling # 3900S Clone DA1E
Real-time PCR instrument Roche LightCycler 480 Can be substituted with similar instruments
Roller mixers Phoenix Instrument RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Thermo Scientific 61870010
Safety-Multifly-needle 21G Sarstedt 851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925
Shaker Duomax 1030 Heidolph Instruments 543-32205-00 Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge Thermo Scientific Heraeus Fresco 17 Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070
ß-Mercaptoethanol Thermo Scientific 21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X) Cell Signaling #12498
Trypan Blue solution Sigma Aldrich 93595-50ML

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Fuchs, A. R., Märklin, M., Heitmann, J. S., Futterknecht, S., Haap, M., Wirths, S., Kopp, H., Hinterleitner, C., Dörfel, D., Müller, M. R. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (142), e58270, doi:10.3791/58270 (2018).

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