Elastische Färbung auf Paraffin-eingebetteten Dias von pT3N0M0 Magenkrebsgewebe
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll der elastischen Färbung vor, um elastische Fasern in pT3N0M0 Magenkrebsgeweben auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Abschnitten zu identifizieren. Anschließend beschreiben wir eine Methode, um zu bestimmen, ob Tumorzellen über die elastische Lamina hinaus eindringen.
Abstract
Die elastische Lamina, die sich in der Regel in der submesothelialen Schicht neben den Peritoneum-Mesothelzellen befindet, ist amphiphil auf Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E), kann aber durch elastische Färbung visualisiert werden. Einer der wichtigen Vorteile der elastischen Färbung ist, dass es leicht zu bestimmen, ob Tumorzellen über die elastische Lamina eingedrungen sind. Dies hilft bei der Untersuchung des Ausmaßes der peritonealen Oberflächeninvasion, wodurch die pT3- und pT4-Stadien bei Magen-Darm-Krebs unterschieden werden. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung elastischer Fasern in den formal infixierten, paraffin-eingebetteten pT3N0M0 Magenkrebsgewebeabschnitten vor. Wir bereiten 5-m Paraffinabschnitte auf Dias fest, und dann werden alle Dias während des Färbevorgangs deparaffiniert und rehydriert. Anschließend werden alle Abschnitte durch Kaliumpermanganat oxidiert, mit Oxalsäure gebleicht, durch elastische Färbung gebeizt und von Van Gieson gegengefärbt. Schließlich untersuchen wir die Wirkung der Färbung; elastische Lamina ist blau-schwarz gefärbt und Kollagenfasern sind rot gefärbt, während die Krebszellen in verschiedenen Gelbtönen gefärbt sind. Wir beschreiben auch detailliert die Methoden zur Bestimmung der Positionsbeziehung zwischen Krebszellen und elastischer Lamina. Diese Methode ist einfach, kostengünstig und weit verbreitet bei der Identifizierung von peritonealen Oberflächeninvasion bei Magen-Darm-Krebs wegen seiner hervorragenden Selektivität für elastische Fasern und authentische Ergebnisse.
Introduction
Gemäß dem Tumor-, Knoten- und Metastasen-(TNM)-Krebs-Staging-System ist die Prognose von Magenkrebs im pathologischen Stadium pT4 signifikant schlechter als bei pT3 (8. UICC/AJCC)1. Bei Magenkrebs hängt die Klassifizierung des Primärtumors (pT) in der Regel von der Tiefe der Tumorinvasionab 2. Pathologisches Stadium pT3 Magenkrebs ist definiert als Krebs, der durch die muscularis propria in subserosales Gewebe eindringt, während pT4 Magenkrebs als Krebs definiert wird, der auf die Oberfläche des viszeralen Peritoneums eindringt. Das Vorhandensein der peritonealen Oberflächeninvasivität ist der Schlüssel, um die beiden Stadien2zu unterscheiden. Da die peritoneale mesotheliale Zellschicht jedoch sehr dünn ist, könnte sie während der Operation, der postoperativen Behandlung und der Fixierung3beschädigt werden. Darüber hinaus können tumorbedingte entzündliche Veränderungen und Fibrose die normale Anatomie des Peritoneums schädigen, was es sehr schwierig macht, die peritoneale Oberflächeninvasion nur mit H&E-Färbung4genau zu beurteilen. Aktuelle Hilfsdiagnosemethoden wie Zytologie und Immunhistochemie sind von begrenztem diagnostischem Wert5,6, weil sie falsch-positiv sind oder eine geringe Wirtschaftlichkeit haben.
Die serosale Membran umfasst das Peritoneum, Pleura und Perikard und besteht aus dem Mesothel, einer Kellermembran und einer submesotheliaalen Schicht7. Ein gemeinsames histologisches Merkmal der Serosalmembran ist das Vorhandensein einer elastischen Lamina in der submesotheliaalen Schicht, die an die mesotheliale Zellen8,9angrenzt. Elastische Lamina hat eine starke anti-schädliche Fähigkeit und kann als alternativer prognostischer Marker dienen, wenn die Mesothelzellen durch schwere tumorbedingte Entzündungen oder Fibrose zerstört werden3. Elastische Lamina besteht hauptsächlich aus Elastin und Mikrofibril10, die durch elastische Färbung visualisiert werden können. Der Hauptgrund für die Verwendung der elastischen Färbung ist, dass das Elastin eine Wasserstoffbindung mit der phenolischen Gruppe von Resorcin in der Elastinlösung bildet, wodurch elastische Fasern blau-schwarz gefärbt werden. Nach Van Gieson (VG) kontrastierende Färbung, Kollagenfasern können rot gefärbt werden und Muskelfasernund rote Blutkörperchen können gelb 8,11,12,13gebeizt werden.
Die achte Ausgabe der TNM-Inszenierung von Lungenkrebs definiert viszerale Pleurainvasion (T2) als Tumorinvasion jenseits der elastischen Lamina oder eine Invasion an der Oberfläche der viszeralen Pleura2. Studien über Dickdarmkrebs haben gezeigt, dass die elastische Lamina-Invasion bei pT3-Darmkrebs der Grund für schlechte Prognosen sein kann. Die 5-Jahres-Krankheitsfreie und Gesamtüberlebensrate von Dickdarmkrebs haben sich auch als pT4a13,14,15erwiesen. Basierend auf unseren früheren Studien über elastische Färbung, elastische Lamina Invasion wurde festgestellt, dass einen signifikanten negativen Einfluss auf die Prognose von pT3 Magenkrebs haben und sollte auf die gleiche Weise wie pT4a Magenkrebs behandelt werden12. Daher kann diese einfache und kostengünstige Methode dazu beitragen, Unsicherheiten in den Ergebnissen zu beseitigen, die durch H&E-Färbung und andere häufige Einschränkungen im Zusammenhang mit anderen Hilfsdiagnosemethoden, einschließlich Zytologie und Immunhistochemie, unter Andere. Diese Methode kann effizient verwendet werden, um peritoneale Oberflächeninvasionen von Magen-Darm-Krebs zu diagnostizieren, vor allem in einigen mehrdeutigen Fällen. Es ist bequem, da H&E Flecken und andere Flecken es in der Regel schwierig machen, solche Invasionen zu identifizieren. Diese Methode gewährleistet auch eine Zuverlässigkeit der Ergebnisse, da sie sehr selektiv ist, insbesondere für elastische Fasern. Hier führen wir elastische Färbungen durch, um festzustellen, ob Tumorzellen in die elastische Lamina bei pT3N0M0 Magenkrebs12eingedrungen sind.
Diese Methode wird zur Identifizierung von elastischen Fasern in Geweben auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Abschnitten verwendet und kann auch für gefrorene Abschnitte verwendet werden. Hier wählen wir Paraffin-eingebettete Abschnitte für die beste Erhaltung der Zell- und Gewebemorphologie. Alle Schritte in diesem Protokoll finden bei Raumtemperatur statt. In der vorgestellten Studie wird ein kommerzielles Färbeset verwendet, das eine Kaliumpermanganatlösung, eine Oxalsäurelösung, eine Elastinlösung und eine Van Gieson-Lösung enthält.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese hier vorgeschlagene Methode bietet einen genauen Ansatz zur Identifizierung der subserosalen elastischen Lamina. Die Methode kann verwendet werden, um zu bewerten, ob Tumorzellen in die elastische Lamina bei pT3N0M0 Magenkrebs eingedrungen sind12. Elastische Lamina ist rötlich in H&E-gefärbten Abschnitten, die nicht leicht von Kollagenfasern unterschieden werden konnte, und andere bestehende Hilfsdiagnosemethoden, wie Zytologie und Immunhistochemie, übten ebenfalls einen begrenzten diagno…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Unterstützung zum Teil von der National Natural Science Foundation (NO.81401902 und NO.81501992) und der Hunan Natural Science Foundation (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). Das Manuskript wurde von Guang Lei geschrieben. Das ganze Experiment wird von Guang Lei und Haiyan Yang durchgeführt. Die Autoren danken der Hilfe von Pathologen und Stipendiaten, die patientengebundene Patientendaten verfolgen.
Materials
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
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