Tinción elástica en diapositivas incrustadas en parafina de tejido de cáncer gástrico pT3N0M0
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de tinción elástica para identificar fibras elásticas en los tejidos de cáncer gástrico pT3N0M0 en secciones fijas de formalina, incrustadas en parafina. Posteriormente, describimos un método para determinar si las células tumorales invaden más allá de la lámina elástica.
Abstract
La lámina elástica, que generalmente se encuentra en la capa submesotelial, adyacente a las células mesoteliales del peritoneo, es anfifílica sobre la hematoxilina y la tinción de eosina (H&E), pero se puede visualizar a través de la tinción elástica. Uno de los beneficios importantes de la tinción elástica es que facilita la determinación de si las células tumorales han invadido más allá de la lámina elástica. Esto ayuda a examinar el alcance de la invasión de la superficie peritoneal, distinguiendo así las etapas pT3 y pT4 en el cáncer gastrointestinal. En este estudio, presentamos un protocolo para identificar fibras elásticas en las secciones de tejido de cáncer gástrico pT3N0M0 fijados por formalina, incrustados en parafina. Preparamos secciones de parafina de 5 m fijadas en los portaobjetos, y luego todas las diapositivas se desparanyan y se rehidratan durante el procedimiento de tinción. Posteriormente, todas las secciones son oxidadas por permanganato de potasio, blanqueados por ácido oxálico, manchados por manchas elásticas y contrarrestados por Van Gieson. Por último, examinamos el efecto de la tinción; la lámina elástica se tiñe de color azul-negro y las fibras de colágeno se tiñen de rojo, mientras que las células cancerosas se tiñen en diferentes tonos de amarillo. También describimos en detalle los métodos utilizados para determinar la relación posicional entre las células cancerosas y la lámina elástica. Este método es simple, de bajo costo, y ampliamente aplicable en la identificación de la invasión superficial peritoneal en el cáncer gastrointestinal debido a su excepcional selectividad para fibras elásticas y resultados auténticos.
Introduction
Según el sistema de estadificación del cáncer de tumor, nodo y metástasis (TNM), el pronóstico del cáncer gástrico en la etapa patológica pT4 es significativamente peor que el de pT3 (8o UICC/AJCC)1. Con el cáncer gástrico, la clasificación del tumor primario (pT) generalmente depende de la profundidad de la invasión tumoral2. El cáncer gástrico pT3 en estadio patológico se define como el cáncer invadiendo a través de la musculación propria en los tejidos subserosales, mientras que el cáncer gástrico pT4 se define como cáncer que penetra en la superficie del peritoneo visceral. La presencia de la invasividad de la superficie peritoneal es la clave para distinguir las dos etapas2. Sin embargo, debido a que la capa de células mesoteliales peritoneales esmuy delgada, podría dañarse durante la cirugía, el tratamiento postoperatorio y la fijación 3. Además, los cambios inflamatorios relacionados con tumores y la fibrosis pueden dañar la anatomía normal del peritoneo, lo que hace que sea muy difícil juzgar con precisión la invasión de la superficie peritoneal usando sólo la tinción H&E4. Los métodos actuales de diagnóstico auxiliar, como la citologíay la inmunohistoquímica, son de valor diagnóstico limitado 5,6 porque son falsos positivos o tienen una baja rentabilidad.
La membrana serosal incluye el peritoneo, la pleura y el pericardio, y se compone del mesotelio, una membrana del sótano y una capa submesotelial7. Una característica histológica común de la membrana serosal es la presencia de una lámina elástica en la capasubmesotelial, adyacente a las células mesoteliales 8,9. La lamina elástica tiene una fuerte capacidad antirticida y puede servir como un marcador de pronóstico alternativo si las células mesoteliales son destruidas por inflamación grave relacionada con tumores o fibrosis3. La lámina elástica se compone principalmente de elastina y microfibril10,que se puede visualizar mediante tinción elástica. La razón principal detrás del uso de la tinción elástica es que la elastina forma un enlace de hidrógeno con el grupo fenólico de resorcinol en la solución de elastina, haciendo que las fibras elásticas se tiñen de azul-negro. Después de van Gieson (VG) manchas contrastantes, las fibras de colágeno se pueden teñir de rojo y las fibras musculares y los glóbulos rojos se pueden teñir de amarillo8,11,12,13.
La octava edición de la estadificación TNM del cáncer de pulmón define la invasión pleural visceral (T2)como una invasión tumoral más allá de la lámina elástica o una invasión en la superficie de la pleura visceral 2. Los estudios sobre el cáncer colorrectal han demostrado que la invasión de la lámina elástica en el cáncer colorrectal pT3 puede ser la razón de los malos pronósticos. También se ha demostrado que la tasa de supervivencia global de 5 años libre de enfermedades y de supervivencia global del cáncer colorrectal es como pT4a13,14,15. Según nuestros estudios previos sobre tinción elástica, se ha encontrado que la invasión de lamina elástica tiene una influencia negativa significativa en el pronóstico del cáncer gástrico pT3 y debe tratarse de la misma manera que el cáncer gástrico pT4a12. Por lo tanto, este método simple y rentable puede ayudar a eliminar la incertidumbre en los resultados obtenidos a través de la tinción de H&E, y otras limitaciones comunes asociadas con otros métodos de diagnóstico auxiliar, incluyendo citología e inmunohistoquímica, entre Otros. Este método se puede utilizar eficientemente para diagnosticar invasiones superficiales peritoneales de cáncer gastrointestinal, especialmente en algunos casos ambiguos. Es conveniente ya que la mancha de H&E y otras manchas generalmente hacen que sea difícil identificar tales invasiones. Este método también garantiza una fiabilidad de los resultados ya que es muy selectivo, especialmente a las fibras elásticas. Aquí, llevamos a cabo la tinción elástica para determinar si las células tumorales han invadido la lámina elástica en el cáncer gástrico pT3N0M012.
Este método se utiliza para identificar fibras elásticas en tejidos en secciones fijas en formalina, incrustadas en parafina, y también se puede utilizar para secciones congeladas. Aquí, elegimos secciones incrustadas en parafina para el mejor mantenimiento de la morfología celular y tisular. Todos los pasos de este protocolo tienen lugar a temperatura ambiente. En el estudio presentado se utiliza un kit de tinción comercial que incluye una solución de permanganato de potasio, una solución de ácido oxálico, una solución de elastina y la solución de Van Gieson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método propuesto aquí proporciona un enfoque preciso para identificar la lámina elástica subserosal. El método se puede utilizar para evaluar si las células tumorales han invadido la lámina elástica en el cáncer gástrico pT3N0M012. La lámina elástica es rojiza en secciones teñidas con H&E, que no se podía distinguir fácilmente de las fibras de colágeno, y otros métodos de diagnóstico auxiliares existentes, como la citología y la inmunohistoquímica, también ejercieron un v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo en parte de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (NO.81401902 y NO.81501992) y la Fundación de Ciencias Naturales de Hunan (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). El manuscrito está escrito por Guang Lei. Todo el experimento es realizado por Guang Lei y Haiyan Yang. Los autores agradecen la asistencia de patólogos y de becarios que siguen los datos de los pacientes.
Materials
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
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