निस्र्पक प्रोटीन आधारित Hydrogels के लिए बल-क्लैंप Rheometry
Summary
एक नया बल दबाना rheometry तकनीक कम मात्रा में प्रोटीन आधारित hydrogel एक आवाज का तार मोटर और एक बल संवेदक के बीच सीमित नमूनों की यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक एनालॉग आनुपातिक-अभिंन व्युत्पंन (PID) प्रणाली के लिए अनुमति देता है ‘ clamping ‘ बल के वांछित प्रोटोकॉल के लिए अनुभवी ।
Abstract
यहां, हम एक बल दबाना rheometry विधि का वर्णन करने के लिए प्रोटीन आधारित hydrogels के यांत्रिक गुणों की विशेषताएं । यह विधि एक रेखीय ध्वनि-कुंडल मोटर और एक बल transducer के बीच सीमित कर रहे हैं जो बेलनाकार प्रोटीन-आधारित hydrogel नमूनों पर नियंत्रित-बल प्रोटोकॉल लागू करने के लिए एक एनालॉग आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न (PID) सिस्टम का उपयोग करता है । ऑपरेशन के दौरान, PID प्रणाली मापा और सेट-पॉइंट बल के बीच अंतर को कम करके एक पूर्वनिर्धारित बल प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए hydrogel नमूना का एक्सटेंशन समायोजित कर देता है । प्रोटीन आधारित hydrogels के लिए यह अनूठा दृष्टिकोण बहुत कम मात्रा में hydrogel नमूनों के tethering सक्षम बनाता है (< 5 µ l) विभिन्न प्रोटीन सांद्रता के साथ. बल के तहत रैंप प्रोटोकॉल, जहां लागू तनाव बढ़ जाती है और समय के साथ रैखिक घट जाती है, प्रणाली लोच और हिस्टैरिसीस के साथ जुड़े व्यवहार के अध्ययन में सक्षम बनाता है (संयुक्त राष्ट्र) प्रोटीन की तह और मानक लोचदार की माप और viscoelastic पैरामीटर्स । के तहत लगातार बल, जहां बल पल्स एक कदम की तरह आकार है, लोचदार प्रतिक्रिया, बल में परिवर्तन के कारण, viscoelastic प्रतिक्रिया है, जो प्रोटीन डोमेन से आता है और खुलासा से जोड़ा गया है । विभिन्न यांत्रिक perturbations लागू करने में अपनी कम मात्रा के नमूने और बहुमुखी प्रतिभा के कारण, बल-क्लैंप rheometry एक थोक दृष्टिकोण का उपयोग कर बल के तहत प्रोटीन की यांत्रिक प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए अनुकूलित है.
Introduction
अद्वितीय भौतिक गुण होने के अलावा, प्रोटीन आधारित hydrogels एक ‘ पुल ‘ में कई अरब अणुओं की माप को सक्षम करने से बल स्पेक्ट्रोस्कोपी क्रांति का वादा पकड़, इस प्रकार भीड़ भरे वातावरण में प्रोटीन के अध्ययन को सक्षम करने, त्वचा और अंय ऊतकों में सामना करना पड़ा उन लोगों के लिए इसी तरह । प्रोटीन डोमेन hydrogels अंदर मुड़े हुए रहते हैं, उनके जैव यांत्रिक प्रतिक्रिया के अध्ययन के बल, बाध्यकारी भागीदारों, और रासायनिक स्थितियों की अनुमति । इसके अतिरिक्त, hydrogels अंदर प्रोटीन डोमेन के यांत्रिक प्रतिक्रिया एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक के साथ देखा प्रतिक्रिया जैसा दिखता है । उदाहरण के लिए, रासायनिक denaturants और ऑक्सीकरण एजेंटों जोड़ राज्य की स्थिरता में कमी, दोनों एकल प्रोटीन डोमेन स्तर1,2,3 पर और macroscopic स्तर4,5 पर , 6 , 7. इसी प्रकार, osmolytes एक प्रोटीन की स्थिरता में वृद्धि8,9, hydrogels की viscoelastic प्रतिक्रिया में कमी के लिए अग्रणी, एक ही बल की स्थिति के लिए7,10.
कई तरीकों या तो शारीरिक संपर्क11,12 या आबंध पार-4,13को जोड़ने का उपयोग करके, प्रोटीन संश्लेषित hydrogels आधारित करने के लिए लागू किया गया है । आबंध प्रतिक्रियाओं निश्चित पार से जोड़ने स्थानों के लिए अनुमति देते हैं और इन hydrogels यांत्रिक या रासायनिक perturbations को हटाने पर प्रारंभिक राज्य की वसूली कर सकते हैं. आबंध पार के लिए एक सफल दृष्टिकोण को जोड़ने आबंध कार्बन उजागर tyrosine अमीनो एक ऑक्सीडेंट के रूप में अमोनियम persulfate (ए. पी. एस.) का उपयोग कर एसिड के बीच कार्बन बांड बनाने पर निर्भर करता है और एक ruthenium (द्वितीय) एक सर्जक के रूप में नमक (1 चित्रा)14। सफेद प्रकाश के लिए जोखिम पर, केंद्रित प्रोटीन का एक समाधान एक hydrogel में बदल दिया जा सकता है । जब प्रतिक्रिया शुरू होता है को नियंत्रित करके, प्रोटीन-ए पी एस मिश्रण किसी भी कास्टिंग के रूप में इंजेक्ट किया जा सकता है, जैसे polytetrafluoroethylene (PFTE) ट्यूबों (आंकड़ा 1b और 1C), एक अत्यंत छोटे समाधान की मात्रा15के उपयोग की अनुमति । इसके अलावा, सफेद प्रकाश के उपयोग को ट्रिगर करने के लिए पार-फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक सीमित ब्लीचिंग में प्रतिक्रिया परिणाम जोड़ने और फ्लोरोसेंट मार्करों (चित्रा 1) के साथ समग्र hydrogels के निर्माण की अनुमति देता है । अंय प्रोटीन आधारित hydrogel गठन के तरीकों का उपयोग करें पार-SpyTag-ऑबजर्वर आबंध16संपर्क, अमीन पार glutaraldehyde13, या बायोटिन-streptavidin बातचीत के माध्यम से जोड़ने के आधार पर जोड़ने17।
गतिशील यांत्रिक विश्लेषण (DMA) वर्तमान में एक तकनीक है बड़े पैमाने पर पॉलिमर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया hydrogels आधारित13,18. जबकि DMA लगातार बल प्रोटोकॉल को लागू कर सकते है करने के लिए, यह है Young moduli पर 10 केपीए, और बड़े नमूने की मात्रा से अधिक २०० µ l19। इन सीमाओं के कारण, प्रोटीन hydrogels आम तौर पर भी इस तकनीक से जांच की जा नरम हैं । के रूप में इंजीनियर polyproteins बहुलक से संश्लेषित करने के लिए कठिन हैं, क्योंकि वे एक जीवित प्रणाली का उत्पादन करने की आवश्यकता है, इस तरह के उच्च मात्रा में अक्षम हैं, सर्वश्रेष्ठ4,15। इसके अलावा, सबसे जैविक ऊतकों 10 केपीए से नरम हैं । कई दृष्टिकोण जैविक नमूनों के लिए विकसित किए गए, विशेष रूप से मांसपेशियों की लोच के अध्ययन में20,21. इन तकनीकों को भी प्रतिक्रिया के तहत संचालित करने के लिए लगातार बल लागू कर सकते है लेकिन छोटे व्यास (माइक्रोन रेंज में) के साथ नमूनों के लिए अनुकूलित कर रहे है बहुत कम समय के लिए बल (आमतौर पर कम 1 एस से अवगत कराया) ।
प्रोटीन आधारित hydrogels सफलतापूर्वक संशोधित rheometry तकनीकों के साथ अध्ययन किया गया । उदाहरण के लिए, एक रिंग आकार में hydrogel कास्टिंग विस्तार rheometry के उपयोग के लिए एक्सटेंशन4,22के एक समारोह के रूप में अनुभवी बल में परिवर्तन को मापने के लिए अनुमति देता है । प्रोटीन आधारित hydrogels के rheological गुणों के अध्ययन के लिए अंय दृष्टिकोण नियंत्रित कतरनी-तनाव rheometry का उपयोग करें । इन तकनीकों को भी कम नमूना मात्रा को प्राप्त करने और नरम सामग्री बर्दाश्त कर सकते हैं । हालांकि, इन तरीकों की क्षमता को खींच बलों है कि vivo मेंखुलासा प्रोटीन का कारण है, और युवा मापांक जटिल सिद्धांत है कि विभिंन मांयताओं और23सुधार की आवश्यकता के आधार पर गणना की है ।
हम हाल ही में एक नया दृष्टिकोण है कि प्रोटीन की एक छोटी मात्रा का उपयोग करता है, व्यास के साथ ट्यूबों के अंदर बहुलक की रिपोर्ट < 1 mm । हमारी इस तकनीक के पहले कार्यांवयन लंबाई में काम कर रहा था, मोड दबाना, जहां जेल वांछित प्रोटोकॉल15के बाद बढ़ाया गया था । इस विधि में, प्रोटीन दोनों विस्तार और बल में एक निरंतर परिवर्तन का अनुभव जबकि डोमेन प्रकट, डेटा व्याख्या बोझिल बना । हाल ही में, हम एक नया बल दबाना rheometry तकनीक है, जहां एक प्रतिक्रिया पाश एक पूर्वनिर्धारित बल प्रोटोकॉल7 (चित्रा 2) के लिए कम मात्रा में प्रोटीन hydrogels बेनकाब कर सकते है की सूचना दी है । एक एनालॉग PID प्रणाली बल संवेदक द्वारा कंप्यूटर से भेजे गए सेट बिंदु के साथ मापा बल तुलना करता है और दो आदानों के बीच अंतर को कम करने के लिए आवाज का तार ले जाकर जेल एक्सटेंशन समायोजित कर देता है । बल के इस ‘ clamping ‘ अब प्रोटीन hydrogels के यांत्रिक को मापने के लिए प्रयोगों के नए प्रकार के लिए अनुमति देता है ।
सेना में रैंप मोड, एक सीमित प्रोटीन hydrogel एक निरंतर वृद्धि और समय के साथ बल की कमी अनुभव करता है । PID किसी भी viscoelastic विरूपण के लिए एक गैर-रेखीय तरीके में एक्सटेंशन बदलकर, प्रोटीन और hydrogel निर्माण के प्रकार के आधार पर क्षतिपूर्ति करती है । सेना रैंप का मुख्य लाभ यह है कि यह ऐसे युवा मापांक और ऊर्जा अपव्यय के रूप में मानक मापदंडों, के ठहराव की अनुमति देता है, एक खुलासा और प्रोटीन डोमेन का खुलासा करने के लिए कारण ।
निरंतर बल मोड में, लागू बल एक कदम की तरह फैशन में परिवर्तन । इस मोड में, जेल फैली हुई है और जब बल वृद्धि हुई है या कम, क्रमशः, एक समय पर निर्भर विकृति के बाद अनुबंध लोचदार । इस viscoelastic विकृति, जगह ले जा रहा है, जबकि जेल एक निरंतर शक्ति का अनुभव, सीधे डोमेन से संबंधित है खुलासा/ एक सरलीकृत तरीके से, इस विस्तार के रूप में देखा जा सकता है कई अरब एकल अणु अंश के बराबर एक साथ औसत और मापा सभी एक ही बार में । लगातार बल प्रोटोकॉल बल और समय के एक समारोह के रूप में रेंगना और प्रोटीन hydrogels की छूट का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बल के एक समारोह के रूप में, BSA आधारित प्रोटीन hydrogels के लिए, हम हाल ही में दिखाया गया है कि वहां लोचदार और viscoelastic विस्तार के बीच एक रैखिक निर्भरता है और लागू तनाव7के साथ हटना ।
यहां हम विस्तार एक बल के आपरेशन-दबाना rheometer प्रोटीन का एक मिश्रण से बना जैल का उपयोग कर (8 डोमेन24, एल के रूप में चित्रित8) और एक प्रोटीन एल eGFP का निर्माण (एल-eGFP), जो समग्र hydrogel फ्लोरोसेंट और आसान बनाता है प्रदर्शन.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ, हम एक बल दबाना rheometry तकनीक का वर्णन करने के लिए कम मात्रा में प्रोटीन आधारित hydrogels के यांत्रिक प्रतिक्रिया की जांच । साथ ही, एक समान बेलनाकार कम मात्रा वाले प्रोटीन hydrogel नमूना को संश्लेषित करने ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अनुसंधान वृद्धि पहल (पुरस्कार सं 101X340), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, प्रमुख अनुसंधान इंस्ट्रूमेंटेशन कार्यक्रम (अनुदान सं. से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । PHY-१६२६४५०), ग्रेटर मिलवॉकी फाउंडेशन (शॉ अवार्ड) और यूनिवर्सिटी ऑफ विस्कॉंसिन सिस्टम (एप्लाइड रिसर्च ग्रांट).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
Referências
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