蛋白質ベースのゲルを特徴付けるため力クランプ ワイヤ
Summary
新しい力クランプ ワイヤ技術を使用して、ボイスコイル モーターと力センサーの間の連結台数の少ないタンパク質ハイドロゲル サンプルの機械的性質を調査します。アナログ比例・積分・微分 (PID) システムは、目的のプロトコルを経験の力の ‘固定’ のことができます。
Abstract
ここでは、力クランプ ワイヤは、蛋白質ベースのゲルの力学的特性を特徴付ける方法をについて説明します。このメソッドでは、アナログの比例・積分・微分 (PID) システムを使用して、線形ボイスコイル モーターと力覚セン繋留円筒蛋白質ベースのゲルのサンプルの制御プロトコルを適用します。操作中には、PID システムは、測定とセット ポイントとの間の違いを最小限に抑えることによって、定義済みプロトコルに従うハイドロゲル サンプルの拡張機能を調整します。蛋白質ベースのゲルにこのユニークなアプローチは、異なるタンパク質濃度で非常に低いボリューム ハイドロゲル サンプル (< 5 μ L) のテザリング可能。 にします。力ランプ プロトコル、どこ、応力は増加し、時間とともに直線的に減少、下でシステムにより、タンパク質と標準的な弾性の測定 (国連) 折り畳みに関連する弾力性とヒステリシス動作の研究、粘弾性パラメーター。定数力、力パルスがステップのような形、弾性応答のため力の変化には、変性と巻き戻り蛋白質ドメインからなる粘弾性応答から分離されて。少量サンプルなど様々 な力学的摂動の適用の多様性により力クランプ ワイヤは一括アプローチを使用して力の下で蛋白質の力学的応答を調査に最適です。
Introduction
独特な物理的性質を持っていることから離れて蛋白質ベースのゲルは、従って混雑した環境で、タンパク質の研究を有効にする 1 つの ‘引き’ でいくつかの億分子の測定を有効にすることによって力分光法を革命の約束を保持します。皮膚や他の組織に発生したものに似ています。タンパク質ドメインがパートナーとの化学的条件のバインドを強制的に、彼らの生体力学的応答の研究を許可するハイドロゲル内折れ曲がったまま。さらに、ゲル内のタンパク質ドメインの生体力学的応答分子力の分光学の技術を見られる応答に似ています。たとえば、化学変性剤と酸化剤を小さくたたんだ状態、単一のタンパク質ドメイン レベル1,2,3と巨視的レベル4、5の両方の安定性,6,7します。 同様に、浸透圧物質が単一タンパク質8,9、同じ力の条件7,10のゲルの粘弾性応答の減少につながるの安定性を高めます。
いくつかのアプローチは蛋白質ベースのゲルを合成するいずれかによって実装されている物理的相互作用11,12または共有結合性の架橋4,13を使用しています。共有結合反応固定架橋位置を可能にする、これらのゲルは、機械的又は化学的摂動の除去時に初期状態を回復できます。共有結合性の架橋に成功したアプローチは、イニシエーター (図 1)14としてルテニウム (II) 塩、酸化剤として過硫酸アンモニウム (AP) を使用して公開されるチロシンのアミノ酸間の共有結合の炭素-炭素結合を形成に依存します。白色光を浴びること、集中の蛋白質の解決はハイドロゲルに変換できます。制御することによって反応開始、タンパク質-APS ミックスはどんなキャスティング フォームに注入できますポリテトラフルオロ エチレン (PFTE) など管 (図 1 bと1 C) を使用できます非常に小規模のソリューション ボリューム15。さらに、白色光架橋反応を誘発するの使用は蛍光タンパク質の限られた漂白の結果し、蛍光マーカー (図 1) と複合ゲルの定式化をできます。その他タンパク質ハイドロゲル形成方法は、SpyTag SpyCatcher 作用16、アミン架橋経由グルタルアルデヒド13、またはビオチン ストレプトアビジン相互作用17に基づく架橋を使用します。
動的機械分析 (DMA) は現在広く高分子ヒドロゲル13,18を研究に使用される手法です。DMA は、生体に一定の力プロトコルを適用できますが、10 kPa と以上 200 μ L19の大規模なサンプル ボリューム上のヤング係数が必要です。これらの制限によりタンパク質ハイドロゲルは、一般的にこの手法によって調査されるには柔らかすぎます。設計されたコロナ リビング システムを生成が必要なため、ポリマーよりも合成するは難しいと、このような高ボリューム、ベスト4,15で効率的。さらに、ほとんどの生体組織は 10 kPa より柔らかいです。いくつかのアプローチは、筋肉の弾力性20,21の研究では特に、生体試料の開発されました。これらの技術は一定外力を適用するフィードバックの下で動作することができますもが非常に短い時間のための力にさらされている (ミクロン) の小径のサンプル用に最適化された (通常より 1 秒)。
蛋白質ベースのゲルを変更したワイヤを用いて正常に調べた。たとえば、ヒドロゲルを鋳造リング形状の拡張4,22の関数として経験を積んだ力の変化を測定する伸張のワイヤの使用をことができます。蛋白質ベースのゲルのレオロジー特性を研究するための他のアプローチは、せん断応力を制御ワイヤを使用します。これらの技術は低いサンプル ボリュームを達成し、ソフトマテリアルを容認できます。しかし、その原因タンパク質アンフォールディング生体内で、強制的にこれらのメソッドの欠如引きを模倣する能力、ヤング率は、さまざまな仮定や修正23を必要とする複雑な理論に基づいて計算されます。
中径管重合タンパク質の少量を利用した新しいアプローチを行ってきた最近 < 1 mm。この技術の私達の最初の実装目的のプロトコル15次ゲルを伸ばした長さクランプ モードで動作していた。この方法で蛋白質作りを体験拡張および力の両方の連続的な変更ドメインを展開、一方データ解釈面倒。最近では、我々 はフィード バック ループが定義済み力プロトコル7 (図 2) に少量の蛋白質ゲルを公開できる新しい力クランプ ワイヤ技術を報告しています。アナログ PID システムはコンピューターから送信セット ポイントと力センサーを用いて力を比較し、2 つの入力の差を最小限に抑えるためにボイスコイルを動かすことによってゲル拡張子を調整します。力のこの ‘固定’ 蛋白質ゲルのバイオメカニクスを測定する実験の新しい種類今できます。
力ランプ モードで係留タンパク質ハイドロゲルは、定数の増加と時間の力の減少を経験します。PID は、タンパク質とゲル製剤の種類によって、非線形の方法で拡張子を変更する任意の粘弾性変形を補正します。力のランプの主な利点は、ヤング率と、展開とタンパク質ドメインの巻き戻しのためのエネルギー散逸などの標準的なパラメーターの定量化できます。
定数強制モードで応用力を段階的な方法で変更します。このモードでゲルは伸びると弾性力が増加または減少し、それぞれになると契約、時間依存型変形が続きます。ゲル経験一定力時に行われ、この粘弾性変形はドメインの展開/折りたたみを直結します。簡略化された方法でこの拡張機能は、十億の単一分子トレース一緒に平均化され、すべてを一度に測定はいくつかの等価なものとして見なすことができます。クリープと力と時間の関数として蛋白質ゲルの緩和を検討する定数力プロトコルを使用できます。BSA を用いたタンパク質ゲルのための力の関数として弾性および粘弾性の拡張と適用ひずみ7の反動の線形依存関係があることを最近示しました。
ここでは、全体的なハイドロゲルを蛍光簡単に L 蛋白質の混合物 (8 ドメイン24L8として描かれている) とタンパク質 L eGFP コンストラクト (L eGFP) から作られた複合ゲルを使用して力クランプ レオメータの操作を詳細します。示してください。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、低ボリューム蛋白質ベースのゲルの力学的応答特性を調査する力クランプ ワイヤ手法について述べる。また、制服の円筒低ボリューム蛋白質ゲルのサンプルを合成するプロトコルが提供されます。フックで任意の力学的変形または蛋白質ベースのゲルのサンプルやゲルの滑りの損傷を引き起こすことがなく各種の弾力性と蛋白質ベースのゲルの種類の結び方を記述するプロトコルに…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は研究成長イニシアチブ (賞号 X 340 101)、全米科学財団、主要なインストルメンテーション研究グラント号からの財政支援を認めるPHY-1626450)、大きいミルウォーキー財団 (ショウ賞) とウィスコンシン大学システム (応用研究グラント)。
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
Referências
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