Новая техника Реометрия сил зажим используется для изучения механических свойств образцов низким объемом гидрогеля на основе белков, привязал между двигателем катушка и датчик силы. Аналоговая система пропорционального интеграл производная (PID) позволяет «зажимной» силы опытных желаемого протокола.
Здесь мы описываем метод Реометрия силы зажим для характеризовать биомеханические свойства гидрогели на основе белков. Этот метод использует систему (PID) аналоговый пропорциональный интеграл производная применять контролируемых силу протоколы на цилиндрических гидрогеля на основе белков образцы, которые привязаны между линейной-катушка мотор и преобразователь силы. Во время операции PID система регулирует расширение образца гидрогеля следовать предопределенных силу Протокола путем сведения к минимуму разницу между силами измеренных и заданное значение. Этот уникальный подход к гидрогели на основе белка позволяет привязывать образцов (< 5 мкл) чрезвычайно низким объемом гидрогеля с концентрациями различных белков. Под силу рампа протоколы, где приложенного напряжения увеличивается и уменьшается линейно со временем, эта система позволяет исследования эластичности и гистерезиса поведений, связанных с складные (ООН) белков и измерение стандартного эластичное и Вязкоупругие параметры. Под постоянной силы, где сила импульса имеет шаг образную форму, эластичные ответ, из-за изменений в силу, является отделенных от вязкоупругих ответ, который приходит из домена протеина разворачивается и складывая. Благодаря низким объемом выборки и универсальность в применении различных механические возмущения сил зажим Реометрия оптимизирована для исследования механических реакции белков под силу, с помощью массового подхода.
Наряду с уникальными физическими свойствами, гидрогели на основе белков обещают революционные силы спектроскопии, позволяя измерения нескольких миллиардов молекул в одной «тянуть», таким образом позволяя исследование белков в переполненном средах, аналогичны тем, с которыми кожи и других тканей. Доменов протеина остаются сложенном внутри гидрогели, позволяя изучение их биомеханических ответ, чтобы заставить привязки партнеров и химических условий. Кроме того биомеханические ответ доменов протеина внутри гидрогели напоминает ответ, видели с методами спектроскопии одной молекулы силой. Например химическое denaturants и окисляющих агентов уменьшить стабильность сложенном состоянии, как в одного белка домена уровня1,2,3 , так и на макроскопическом уровне4,5 , 6 , 7. Аналогичным образом, osmolytes увеличить стабильность единого белки8,9, ведущих к снижению Вязкоупругий отклик гидрогели, за то же силу условий7,10.
Были осуществлены несколько подходов для синтеза белка на основе гидрогелей, либо с помощью физических взаимодействий11,12 или ковалентных сшивки4,13. Ковалентный реакции позволяют для фиксированных местах сшивки и эти гидрогели можно восстановить исходное состояние после удаления механическое или химическое возмущений. Успешный подход для ковалентной cross-linking опирается на формирование ковалентных углерод углеродных связей между аминокислотами подвергаются тирозина, используя Персульфат аммония (APS) в качестве окислителя и рутений (II) Соль как инициатор (рис. 1)14. Под воздействием белый свет решение концентрированных белков могут быть превращены в гидрогеля. Контролируя когда реакция начинается, белок APS смеси могут быть введены в любой форме литья, например политетрафторэтилена (PFTE) трубы (Рисунок 1B и 1 C), позволяя использовать объем чрезвычайно малые решения15. Кроме того использование белого света для инициирования реакции структурообразования приводит к ограниченным отбеливания флуоресцентных белков и позволяет разработку композитных гидрогели с флуоресцентные маркеры (рис. 1). Другие методы формирования на основе белков Гидрогель использовать сшивки, основанные на SpyTag-SpyCatcher Ковалентный взаимодействия16, Амин сшивки через глютаральдегид13или биотин стрептавидина взаимодействия17.
Динамический механический анализ (ДМА) методика в настоящее время широко используется для изучения на основе полимерных гидрогелей13,18. Хотя DMA может применять постоянной силой протоколы для биоматериалов, он требует модули Юнга над 10 кПа и большой образец объемы более чем 200 мкл19. Из-за этих ограничений гидрогели белка, как правило, слишком мягкий расследовать эту технику. Как инженерии полипротеины труднее синтезировать чем полимеров, так как они требуют живой системы для производства, такие большие объемы являются неэффективными, в лучшие4,15. Кроме того большинство биологических тканей мягче, чем 10 кПа. Для биологических проб, особенно в изучении эластичность мышц20,21были разработаны несколько подходов. Эти методы могут также работать под обратной связи для применения постоянной силой но оптимизированы для образцов с малого диаметра (в диапазоне микрон) подвергается силы за очень короткое время (обычно менее 1 s).
Белка на основе гидрогелей были успешно учился с модифицированных Реометрия методов. Например приведение Гидрогель в форме кольца позволяет использовать объемные Реометрия измерить изменения в опытных силу как функция расширения4,22. Другие подходы для Изучение реологических свойств гидрогели на основе белков используйте Реометрия контролируемого напряжения сдвига. Эти методы можно также достичь объема низких образца и терпеть мягкие материалы. Однако эти методы отсутствие способность имитировать потянув силы что причиной белка разворачивается в естественных условиях, и Юнга рассчитывается на основе сложных теорий, которые требуют различные предположения и исправления23.
Недавно мы сообщили новый подход, который использует небольшой объем белков, полимеризуется внутри трубок с диаметром < 1 мм. Наша первая реализация этого метода работает в режиме длина зажим, где гель был продлен после желаемого протокола15. В этом методе белки опыт непрерывного изменения в расширение и силы в то время как домены разворачиваться, делая толкованием данных громоздким. Недавно мы сообщили новую технику Реометрия сил зажим, где петля обратной связи можно подвергать низким белком гидрогели для предопределенных силу протокола7 (Рисунок 2). Аналоговая система PID сравнивает сил измеряется датчик силы с точкой набор, отправленных с компьютера и корректирует гелевое наращивание, перемещая звуковой катушки для сведения к минимуму разницу между двумя входами. Этот «зажима» сил теперь позволяет для новых типов экспериментов для измерения биомеханики гидрогели белка.
В режиме силы рампа привязанный белка гидрогеля испытывает постоянное увеличение и уменьшение силы со временем. PID компенсирует любые деформации вязкоупругих, изменив расширение нелинейных способом, в зависимости от типа разработки белков и гидрогеля. Главное преимущество силы рамп является, что она позволяет количественного определения стандартных параметров, таких как Юнга и диссипация энергии, благодаря разворачивается и складывая доменов протеина.
В режиме постоянной силы приложенной силы изменений в шаг как моды. В этом режиме гель расширяет и упруго контрактов, когда силы увеличивается или уменьшается, соответственно, следуют деформации зависят от времени. Этот вязкоупругих деформации, происходящих в то время как гель опыт постоянной силой, напрямую связана с домена разворачивается/складывая. В упрощенном виде это расширение можно рассматривать как эквивалент нескольких миллиардов следы одной молекулы вместе в среднем и измерены все сразу. Постоянной силы протоколы могут использоваться для изучения ползучести и релаксации гидрогели белка как функции времени и сил. Как функция силой, гидрогели на основе BSA белка мы недавно показали, что существует линейная зависимость между эластичное и вязкоупругих расширение и отдачи с прикладной штамм7.
Здесь мы подробно операции сил зажим Реометр с использованием композитного гели, сделанные из смеси белков Л (8 доменов24, изображается как L8) и белок L-eGFP конструкцию (L-eGFP), что делает общую гидрогеля, флуоресцентные и легко продемонстрировать.
Здесь мы описываем силы зажим Реометрия техника расследовать биомеханических ответ гидрогели на основе белков низким объемом. Кроме того протокол предоставляется синтезировать образец гидрогеля форма цилиндрическая низким объемом протеина. Протокол также представил, который описы?…
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем финансовую поддержку от исследования роста инициативы (награда № 101 X 340), Национальный научный фонд, приборостроение программы крупных исследований (Грант № PHY-1626450), более Милуоки фонд (Shaw Award) и Университет штата Висконсин системы (прикладные исследования гранта).
SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
Medical Tweezers | |||
Medical scissors | |||
Olympus | |||
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |