Pinza de fuerza espectrométricas para la caracterización de Hidrogeles basados en proteínas
Summary
Una nueva técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera se utiliza para investigar las propiedades mecánicas de muestras de bajo volumen basados en proteína hidrogel ancladas entre un motor de bobina de voz y un sensor de fuerza. Un analógico proporcional-integral-derivado (PID) sistema permite la fijación de la fuerza experimentada en el protocolo deseado.
Abstract
Aquí, describimos un método de espectrométricas de fuerza-abrazadera para caracterizar las propiedades biomecánicas de Hidrogeles basados en proteínas. Este método utiliza un análogo proporcional-integral-derivado (PID) sistema para aplicar protocolos de fuerza controlada en muestras cilíndricas hidrogel basado en proteína, que están ancladas entre un motor de bobina de voz lineal y un transductor de fuerza. Durante la operación, el sistema PID ajusta la extensión de la muestra de hidrogel para seguir un protocolo predefinido fuerza reduciendo al mínimo la diferencia entre las fuerzas medidas y punto. Este enfoque único de Hidrogeles basados en proteínas permite el tethering de hidrogel de muy bajo volumen de muestras (< 5 μl) con concentraciones diferentes de proteínas. Bajo protocolos de la rampa de la fuerza, donde la tensión aplicada aumenta y disminuye linealmente con el tiempo, el sistema permite el estudio de las elasticidad e histéresis comportamientos asociados con el (des) plegamiento de las proteínas y la medida del elástico estándar y parámetros de la viscoelástica. Bajo fuerza constante, donde el pulso de fuerza tiene una forma escalonada, la respuesta elástica, debido al cambio en la fuerza, está desconectada de la respuesta viscoelástica, que proviene del dominio de la proteína despliegue y refolding. Debido a su bajo volumen de muestra y versatilidad en la aplicación de varias perturbaciones mecánicas, fuerza-abrazadera espectrométricas está optimizado para investigar la respuesta mecánica de proteínas bajo fuerza usando un acercamiento a granel.
Introduction
Además de tener características físicas únicas, Hidrogeles basados en proteína mantenga la promesa de revolucionar la espectroscopia de fuerza por lo que permite la medición de varios mil millones moléculas en un ‘jale’, permitiendo el estudio de proteínas en ambientes de hacinamiento, similares a los encontrados en la piel y otros tejidos. Dominios de la proteína siendo doblados dentro de hidrogeles, que permite el estudio de la respuesta biomecánica a la fuerza, enlace de socios y condiciones químicas. Además, la respuesta biomecánica de los dominios de la proteína dentro de los hidrogeles se asemeja a la respuesta considerada técnicas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula. Por ejemplo, desnaturalizantes químicos y agentes oxidantes disminuyen la estabilidad del estado doblado, a la única proteína dominio nivel1,2,3 y en el nivel macroscópico4,5 , 6 , 7. Asimismo, osmolitos aumentan la estabilidad de las proteínas solo8,9, llevando a una disminución de la respuesta viscoelástica de hidrogeles, para la misma fuerza condiciones7,10.
Varios acercamientos se han aplicado para sintetizar Hidrogeles basados en proteínas, ya sea mediante interacciones físicas11,12 o covalentes entrecruzamiento4,13. Reacciones covalentes permiten lugares fijos del cross-linking y estos hidrogeles pueden recuperar el estado inicial a un retiro de las perturbaciones mecánicas o químicas. Un método exitoso para reticulación covalente se basa en formar enlaces covalentes carbono-carbono entre aminoácidos tirosina expuestas con persulfato de amonio (APS) como un oxidante y una sal de rutenio (II) como un iniciador (figura 1)14. Con la exposición a luz blanca, una solución de proteínas concentradas puede transformarse en un hidrogel. Mediante el control cuando la reacción se inicia, la mezcla de proteína-APS se puede inyectar en cualquier forma de fundición, como el politetrafluoroetileno (PTFE) tubos (figura 1B y 1C), permitiendo el uso de una solución extremadamente pequeño volumen15. Además, el uso de luz blanca para desencadenar la reacción de entrecruzamiento produce un blanqueamiento limitada de proteínas fluorescentes y permite la formulación de compuestos hidrogeles con marcadores fluorescentes (figura 1). Otros métodos de formación del hidrogel basado en proteína utilizan Cross-linking basada en la interacción covalente de SpyCatcher SpyTag16, Amina Cross-linking via glutaraldehído13o biotina-estreptavidina interacciones17.
Análisis mecánico dinámico (DMA) es actualmente una técnica ampliamente utilizada para estudios basados en polímeros hidrogeles13,18. Mientras que el DMA puede aplicar protocolos de fuerza constante con biomateriales, requiere módulos de Young sobre 10 kPa, muestra grandes volúmenes y de más de 200 μL19. Debido a estas limitaciones, hidrogeles de proteína generalmente son demasiado blandos ser investigados por esta técnica. Como ingeniería poliproteínas son más difíciles de sintetizar que polímeros, puesto que necesitan un sistema de vida para producir, tales altos volúmenes son ineficientes, en el mejor de4,15. Además, la mayoría de los tejidos biológica es más suave que 10 kPa. Varios métodos fueron desarrollados para muestras biológicas, especialmente en el estudio del músculo elasticidad20,21. Estas técnicas también puede funcionar bajo regeneración al aplicar una fuerza constante pero se optimizan para las muestras con diámetros pequeños (en el rango de micrones) expuestos a la fuerza de muy corto tiempo (normalmente menos de 1 s).
Los hidrogeles basados en proteína con éxito fueron estudiados con técnicas espectrométricas modificado. Por ejemplo, el hidrogel del bastidor en forma de anillo permite el uso de extensional espectrométricas para medir el cambio en la fuerza de la experiencia en función de la extensión4,22. Otros enfoques para el estudio de las propiedades reológicas de Hidrogeles basados en proteína utilizan espectrométricas controlados de tensión de esquileo. Estas técnicas también pueden alcanzar volumen de muestra bajo y tolerar materiales blandos. Sin embargo, estos métodos falta la capacidad para imitar la tracción fuerza causa la proteína despliegue en vivo, y módulo de Young se calcula en base a teorías complejas que requieren varios supuestos y correcciones23.
Nos han informado recientemente de un nuevo enfoque que utiliza una pequeña cantidad de proteínas, polimerizada dentro de tubos con diámetros < 1 mm. Nuestra primera aplicación de esta técnica fue funcionando en modo de pinza de longitud, donde se extendió el gel siguiendo el protocolo deseado15. En este método, las proteínas experimentan un cambio continuo en la extensión y fuerza mientras que revelan los dominios, haciendo complicado la interpretación de los datos. Recientemente, nos hemos informado de una nueva técnica fuerza abrazadera espectrométricas, donde un lazo de regeneración puede exponer hidrogeles de proteína de bajo volumen a una fuerza predefinida protocolo7 (figura 2). Un sistema PID analógico compara la fuerza medida por el sensor de fuerza con el set point en el ordenador y la extensión de gel ajusta moviendo la bobina para reducir al mínimo la diferencia entre las dos entradas. Esta sujeción de la fuerza permite nuevos tipos de experimentos para medir la biomecánica de hidrogeles de proteína.
En el modo de rampa de la fuerza, un hidrogel de proteína atada experimenta un constante aumento y disminución de la fuerza con el tiempo. El PID compensa las deformaciones viscoelásticas cambiando la extensión de una manera no lineal, dependiendo del tipo de formulación de proteína y de hidrogel. La principal ventaja de la rampa de la fuerza es la que permite la cuantificación de parámetros estándar, como módulo de Young y disipación de energía, debido a un unfolding y refolding de dominios de la proteína.
En el modo de fuerza constante, la fuerza aplicada cambia de manera escalonada. En este modo, el gel se extiende y contratos elásticamente cuando la fuerza es aumentar o disminuir, respectivamente, seguido de una deformación dependiente del tiempo. Esta deformación viscoelástica, llevando a cabo mientras el gel experimenta una fuerza constante está directamente relacionada con dominio desplegado/refolding. De forma simplificada, esta extensión puede verse como el equivalente de varios rastros de sola molécula millones como promedio y mide a la vez. Protocolos de constante de fuerza pueden utilizarse para estudiar la fluencia y relajación de hidrogeles de proteína en función de la fuerza y el tiempo. En función de la fuerza, para hidrogeles de proteína BSA, hemos demostrado recientemente que existe una dependencia lineal entre la extensión elástica y viscoelástica y retroceso con la tensión aplicada7.
Aquí detallamos el funcionamiento de un reómetro de fuerza-abrazadera utilizando geles compuestos de una mezcla de proteína L (8 dominios24, representado como L8) y una construcción de la proteína L-eGFP (L-eGFP), que hace el general hidrogel fluorescente y fáciles de demostrar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos una técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera para investigar la respuesta biomecánica de Hidrogeles basados en proteína de bajo volumen. Además, se proporciona un protocolo para sintetizar una muestra de hidrogel de proteína de bajo volumen cilíndrico uniforme. También se presenta un protocolo que describe cómo hacer diferentes tipos de Hidrogeles basados en proteína con diferentes elasticidades sin causar daño a las muestras de hidrogel basado en proteína o deslizamiento del gel ni…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el apoyo financiero de la iniciativa de crecimiento investigación (premio no. 101 X 340), National Science Foundation, programa de instrumentación de investigación principales (Grant no. PHY-1626450), Greater Milwaukee Foundation (Premio de Shaw) y sistema de la Universidad de Wisconsin (beca de investigación aplicada).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
Referências
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