질병-특정 항 체의 생성에 대 한 항 원 리
Summary
설명 된 항 원 자주 나노 입자와 자극 B 세포 활성화에서 생체 외에서 그리고 vivo에서에서 그들의 사용의 준비가 이다. 일관 되 고 강력한 항 체 응답 새로운 땅콩 알레르기 모델의 개발을 주도. 항 원 리를 생성 하기 위한 프로토콜은 다른 항 원 및 예방 모델을 확장할 수 있습니다.
Abstract
항 체 응답은 다양 한 병원 체를 중요 한 보호 면역을 제공합니다. 뿐만 아니라, 어떻게 병원 성 항 체 응답에 알레르기 및 면역 질환 개발 이해 예방 접종에 대 한 강력한 항 체 생성에 높은 관심을 확인 하 고 남아 있습니다. 생성 하는 강력한 항 원 특정 항 체 응답은 아닙니다 사소한. 마우스 모델에서 그것은 종종 유발된 항 체의 수준에 변화의 큰 거래 하는 보조로 예방 접종의 여러 라운드를 필요 합니다. 한 예로 어디 더 강력 하 고 재현할 수 모델 마우스 숫자와 보조의 사용을 최소화 하는 도움이 될 것 이라고 하는 땅콩 알레르기의 마우스 모델에서 이다. 여기에 제시 된 땅콩 알레르기 알레르기의 높은 재현성 마우스 모델이입니다. 두 가지 주요 요인에 의존 하는이 새로운 모델: (1) 항 원 특정 splenocytes adoptively; 쥐의 많은 수에 걸쳐 항 원 특정 메모리 B 및 T 세포의 수를 정상화 순진한 받는 사람 마우스에 땅콩 응 마우스에서 전송 그리고 (2) 받는 사람 마우스 이후 주요 땅콩 알레르기 (Ara h 2)를 표시 하는 자주 나노 입자의 형태에 강한 multivalent immunogen로 밀어 주었다. 이 모델의 주요 장점은 보조의 여러 주사 받은 동물의 수를 최소화 하면서 각 연구에 사용 된 동물의 수를 낮추고 궁극적으로 그것의 재현성. 면역성이 리의 모듈 어셈블리 병원 성 항 체를 포함 하는 다른 알레르기 또는 면역 모델에 상대적으로 손쉬운 적응성을 제공 합니다.
Introduction
음식 알레르기, 미국에서 어린이의 8%와 지난 유행에서 증가 했다 10 년1. 땅콩에 알레르기 어린이의 1%에 영향을 하 고는 일반적으로 능가 해2. 비록 몇 가지 유망한 임상 시험 진행 구두 immunotherapy (OIT), 설 immunotherapy (슬릿), 및 epicutaneous immunotherapy (EPIT)를 포함 하 여 음식 알레르기의 치료에 대 한 현재 아무 치료 FDA 승인 전략은 땅콩 알레르기 성 개인3,,45,6,7,8믹싱되어에 대 한 따라서, 알레르기 성 개인 엄격 하 게 알레르기를 피하기 위해 알레르기를 방지 해야 합니다. 많은 질문 남아 민감성의 노선 및 음식 알레르기 개발의 메커니즘을 기본.
마우스 모델은 새로운 tolerogenic와 둔감 치료9,10,,1112개발 뿐만 아니라 알레르기의 기계 장치를 공부 하기 위한 유용한 도구입니다. 이것은 특히 사실 때문에 주요 땅콩 알레르기 (Ara h 2; Ah2) 간에 또한 몇몇에서 지배적인 알레르기 설명 마우스 모델13,14. 땅콩 알레르기의 마우스 모델 아니라, 관용의 메커니즘 연구에 귀중 한 동안, 결점은 그 변수 하 수 adjuvants의 사용을 필요로. 더 강력한 immunogens 같은 모델의 본질적인 가변성을 최소화 하기 위해 한 가지 방법은 것입니다. 표시는 알레르기 항 원 리는 또한 효율적으로의 속성을가지고 하는 동안 잠재적으로 B 세포 수용 체 (BCR)를 통해 B 세포를 활성화 하는 능력 때문에 좋은 옵션 때문에 B 세포는 강하게 multivalent 항 원에 의해 활성화 됩니다, 비 구체적으로 항 원 제시 하 여 채택 되 고를 통해 T 세포 격실을 못쓰게 셀.
여기, 우리 동산 손쉬운 및 모듈형 전략을 사용 하 여 자주 나노 입자에 항 원 단백질에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 시연 대리 항, 안티-IgM Fab 조각 사용 하 여, 얼마나 강력한 같은 항 원 리 자극 B 세포 활성화에 있을 수 있습니다. Ah2 항을 표시 하는 항 원 리 수 여 감도의 새로운 마우스 모델을 개발 하기 위해 사용 되었다. 이 모델에서 splenocytes에서 확인 된 땅콩 알레르기 생쥐, 땅콩 전용 메모리 B 및 T 세포를 포함 하는 순진한 congenic 쥐로 전송 됩니다. 메모리 항 체 응답 Ah2에 대하여 항 체를 유도 하기 위하여 받는 쥐로 Ah2 함께 활용 된 리의 주입에 의해 유발 됩니다. 녹는 Ah2 하나만 부스트를 이어서 Ah2 특정 항 체를 야기할 강한 과민 반응이이 마우스는 이후에 Ah2 도전 때. 이 방법은 바람직한 땅콩 알레르기 모델 이며 결과 유틸리티 다른 마우스 모델에서 지시 하는 항 원에 의해 구동 있을 수 있습니다 제안 마우스 알레르기 반응을 겪고 매우 균일 한 방식으로 반응 하 고는 보조를 받지 못한, 알레르기 그리고 아마도 autoantigens입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 메서드는 자주 나노 입자에 단백질의 디스플레이 가능 하 게 지질에 단백질의 활용에 대 한 일반적인 프로토콜. 매우 큰 다중 소 단위 단백질을 위해이 프로토콜 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 이상적인 방법은 biorthogonal 화학 연결 전략을 사용할 수 있도록 특정 태그의 소개 것입니다. Recombinantly 단백질을 표현 하는 경우 PEGylated 지질 상업적으로 사용할 수 있는 끝에 사용할 수 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국방부 (W81XWH-16-1-0302 및 W81XWH-16-1-0303)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
Referências
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