Beschreven is de voorbereiding van de antigene Liposomale nanodeeltjes en hun gebruik in stimulerende B-cel activatie in vitro pt in vivo. Consistente en robuuste antilichaam reacties geleid tot de ontwikkeling van een nieuw model van de pindaallergie. Het protocol voor het genereren van antigene liposomen kan worden uitgebreid tot verschillende antigenen en immunisatie modellen.
Antilichaam reacties bieden kritische protectieve immuniteit aan een breed scala aan pathogenen. Er blijft een groot belang bij het genereren van robuuste antilichamen voor vaccinatie evenals begrijpen hoe pathogene antilichaam reacties allergieën en auto-immuunziekte ontwikkelen. Robuuste antigeen-specifieke antilichaam reacties te genereren is niet altijd triviaal. In muismodellen vereist het vaak meerdere rondes van inentingen met adjuvans die tot een grote hoeveelheid variabiliteit in de hoeveelheid opgewekte antilichamen leidt. Een voorbeeld is in muismodellen van pindaallergieën waar meer robuust en reproduceerbare modellen die muis nummers en het gebruik van adjuvante minimaliseren gunstig zou zijn. Hier gepresenteerd is een zeer reproduceerbaar muismodel van pindaallergie anafylaxie. Dit nieuwe model is gebaseerd op twee belangrijke factoren: (1) antigeen-specifieke splenocytes worden adoptively overgebracht van een pinda-gesensibiliseerde muis in een naïef ontvangende muis, normaliseren van het aantal antigeen-specifieke geheugen B – en T-cellen over een groot aantal muizen; en (2) ontvangende muizen zijn vervolgens versterkt met een sterke multivalent immunogeen in de vorm van liposomaal nanodeeltjes worden getoond op het grote pinda allergeen (Ara h 2). Het grote voordeel van dit model is de reproduceerbaarheid, die uiteindelijk het aantal dieren in elke studie verlaagt, terwijl het minimaliseren van het aantal dieren ontvangen meerdere injecties van adjuvans gebruikt. De modulaire vergadering van deze immunogene liposomen biedt relatief facile aanpassingsvermogen aan andere allergische of auto-immune modellen waarbij Pathogeen antilichamen.
Voedselallergie is van invloed op 8% van de kinderen in de Verenigde Staten, en in de prevalentie is toegenomen in de afgelopen tien jaar1. Allergie voor pinda is van invloed op 1% van de kinderen en is niet typisch ontgroeid2. Hoewel verschillende veelbelovende klinische proeven zijn aan de gang voor de behandeling van voedselallergie, met inbegrip van mondelinge immunotherapie (OIT), sublinguale immunotherapie (SLIT) en epicutaneous immunotherapie (EPIT), zijn er momenteel geen FDA-goedgekeurde behandelingsstrategieën voor desensibilisatie pinda-allergische personen3,4,5,6,7,8. Allergische personen moeten daarom strikt allergenen Voorkom anafylaxie. Veel vragen blijven met betrekking tot routes van sensibilisatie en onderliggende mechanismen van voedsel allergie ontwikkeling.
Muismodellen zijn een waardevol instrument voor het bestuderen van de mechanismen van allergie, alsmede het ontwikkelen van nieuwe tolerogenic en desensibilisatie therapieën9,10,11,12. Dit geldt met name omdat het grote pinda allergeen (Ara h 2; Ah2) bij de mens is ook het dominante allergeen in verschillende beschreven muis modellen13,14. Terwijl Muismodellen van de pindaallergie zijn van onschatbare waarde bij het bestuderen van de mechanismen van sensibilisatie en tolerantie, is een nadeel dat ze kunnen variabele worden en het gebruik van hulpstoffen vereisen. Meer potente immunogenen zou één manier om te minimaliseren van de intrinsieke variabiliteit van dergelijke modellen. Omdat B-cellen zijn sterk geactiveerd door multivalent antigenen, zijn antigene liposomen weergeven van het allergeen een goede optie omwille van hun vermogen om potentieel B-cellen activeren door de B-cel receptor (BHG), terwijl ook de eigenschap van efficiënt het compartiment van de T-cel via worden overgenomen door de niet-specifiek antigeen-presentatie priming cellen.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor eiwit antigenen aan Liposomale nanodeeltjes met behulp van een strategie voor facile en modulaire conjugating. Met behulp van een surrogaat antigeen, anti-IgM Fab fragment, we laten zien hoe krachtig deze antigene liposomen kunnen in stimulerende B-cel-activatie. Antigene liposomen weergeven Ah2 antigeen werden gebruikt voor het ontwikkelen van een nieuwe muismodel van toegekende gevoeligheid. In dit model worden splenocytes van geverifieerde pinda allergische muizen, met pinda-specifieke geheugen B – en T-cellen, overgebracht naar de naïeve congenisch muizen. Geheugen antilichaam reacties worden veroorzaakt door injectie van liposomen geconjugeerd met Ah2 in de ontvangende muizen, zodat antilichamen tegen Ah2 ertoe worden aangespoord. Gevolgd door slechts één boost met oplosbare Ah2, leiden Ah2-specifieke antilichamen tot een sterke anafylactische reactie wanneer deze muizen zijn vervolgens uitgedaagd met Ah2. Zoals muizen ondergaan de allergische reactie op een zeer uniforme wijze reageren hebt en niet een adjuvans, deze benadering is een wenselijk pindaallergie model en de uitkomsten suggereren dat het nut in andere Muismodellen gedreven door antigenen die gericht wellicht allergenen en eventueel autoantigens.
De hier geschetste methoden zijn een algemeen protocol voor de vervoeging van een proteïne aan een lipide waarmee de weergave van het eiwit op Liposomale nanodeeltjes. Voor zeer grote multi subeenheid eiwitten, dit protocol mogelijk beperkte nut. De ideale methode zou zijn de invoering van een specifieke code waarmee een biorthogonal chemische koppelen strategie om te worden gebruikt. Als uiting van het eiwit recombinantly, kan dit met behulp van beschikbare site-specifieke strategieën17, en een…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van het ministerie van defensie (W81XWH-16-1-0302 en W81XWH-16-1-0303).
Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
DSPC | Avanti | 850365 | |
DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
CaCl2 | Sigma | C4901 | |
Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |