मॉडलिंग तपेदिक में माइकोबैक्टीरियम marinum संक्रमित वयस्क Zebrafish
Summary
यहां, हम एक वयस्क अपने प्राकृतिक रोगज़नक़ माइकोबैक्टीरियम marinumका उपयोग कर zebrafish में मॉडल मानव तपेदिक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । संक्रमित zebrafish के आंतरिक अंगों से निकाले गए डीएनए और आरएनए मछली में कुल माइक्रोबैक्टीरियल भार और qPCR के साथ मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
माइकोबैक्टीरियम तपेदिक वर्तमान में घातक मानव रोगज़नक़ के कारण १,७००,००० मौतें और १०,४००,००० संक्रमण हर साल है । इस जीवाणु के लिए जोखिम एक निष्फल संक्रमण से एक सक्रिय रूप से प्रगति घातक रोग को लेकर मनुष्यों में एक व्यापक रोग स्पेक्ट्रम का कारण बनता है । सबसे सामांय रूप अव्यक्त तपेदिक है, जो स्पर्शोन्मुख है, लेकिन एक अचानक रोग में पुनः सक्रिय करने की क्षमता है । वयस्क zebrafish और उसके प्राकृतिक रोगज़नक़ माइकोबैक्टीरियम marinum हाल ही में तपेदिक के व्यापक रोग स्पेक्ट्रम का अध्ययन करने के लिए एक लागू मॉडल साबित हो गया है । महत्वपूर्ण बात, सहज विलंबता और reactivation के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के संदर्भ में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं इस मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है । इस अनुच्छेद में, हम वयस्क zebrafish के प्रयोगात्मक संक्रमण के लिए तरीकों का वर्णन, माइक्रोबैक्टीरियल भार की माप के लिए न्यूक्लिक एसिड की निकासी के लिए आंतरिक अंगों के संग्रह और मात्रात्मक पीसीआर द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की मेजबानी । घर में विकसित, एम marinum-विशिष्ट qPCR परख पारंपरिक चढ़ाना तरीकों की तुलना में अधिक संवेदनशील है क्योंकि यह भी गैर विभाजन, निष्क्रिय या हाल ही में मृत आइसोलेटों से डीएनए का पता लगाता है । के रूप में दोनों डीएनए और आरएनए एक ही व्यक्ति से निकाले जाते हैं, यह रोगग्रस्त राज्य के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए संभव है, और मेजबान और रोगज़नक़ जीन-अभिव्यक्ति. तपेदिक के लिए वयस्क zebrafish मॉडल इस प्रकार एक अत्यधिक लागू, गैर स्तनधारी vivo प्रणाली में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के रूप में प्रस्तुत करता है ।
Introduction
Zebrafish (ढाणियो rerio) जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पशु मॉडल है और यह आम हड्डीवाला जीवविज्ञान के लिए एक स्वीकृत मॉडल है । zebrafish के कई क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया गया है अनुसंधान मॉडलिंग मानव रोगों और कैंसर से लेकर विकारों1 और हृदय रोग2 से संक्रमण और प्रतिरक्षा अध्ययन के कई बैक्टीरियल 3 और वायरल संक्रमण4 , 5. इसके अलावा, zebrafish भ्रूण के पूर्व utero विकास zebrafish6 और विषविज्ञान7,8में एक लोकप्रिय मॉडल बना दिया है ।
संक्रमण जीव विज्ञान सहित अनुसंधान के कई क्षेत्रों में, ऑप्टिकली पारदर्शी zebrafish लार्वा सामांयतः उपयोग किया जाता है । पहली प्रतिरक्षा कोशिकाओं 24 एच पोस्ट निषेचन (hpf), जब आदिम मैक्रोफेज9का पता चला रहे है के भीतर दिखाई देते हैं । न्यूट्रोफिल अगले प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ३३ hpf10के आसपास प्रदर्शित कर रहे हैं । Zebrafish लार्वा संक्रमण की प्रारंभिक अवस्था और अनुकूल प्रतिरक्षा कोशिकाओं11के अभाव में जन्मजात उन्मुक्ति की भूमिका के अध्ययन के लिए इस प्रकार व्यवहार्य हैं । हालांकि, अपनी पूरी तरह कार्यात्मक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ वयस्क zebrafish संक्रमण प्रयोगों के लिए जटिलता की एक अतिरिक्त परत प्रदान करता है । टी कोशिकाओं के आसपास का पता लगाया जा सकता है 3 दिन बाद निषेचन12, और बी कोशिकाओं को 4 सप्ताह के बाद निषेचन13कार्यात्मक एंटीबॉडी का उत्पादन कर रहे हैं । वयस्क zebrafish स्तनधारी सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के सभी मुख्य समकक्षों है । मछली और मनुष्यों की प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच मुख्य अंतर एंटीबॉडी isotypes में पाया जाता है और साथ ही लसीकावत् ऊतकों के शरीर रचना विज्ञान में । zebrafish केवल तीन एंटीबॉडी कक्षाएं14है, जबकि मनुष्य पांच15है । अस्थि मज्जा और लिम्फ नोड्स के अभाव में, मछली में प्राथमिक लसीकावत् अंगों गुर्दे और थाइमस16 और तिल्ली, गुर्दे और पेट माध्यमिक लसीकावत् अंगों17के रूप में सेवा कर रहे हैं । इन मतभेदों के बावजूद, अपनी जंमजात और अनुकूली कोशिकाओं के पूर्ण प्रतिरक्षा शस्त्रागार के साथ, वयस्क zebrafish एक उच्च लागू है, आसान करने के लिए उपयोग करते हैं, गैर स्तनधारी मॉडल मेजबान रोगज़नक़ बातचीत अध्ययन के लिए ।
zebrafish हाल ही में तपेदिक के अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य मॉडल के रूप में स्थापित किया गया है18,19,20,21,22। तपेदिक माइकोबैक्टीरियम तपेदिककी वजह से एक हवाई रोग है । विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, तपेदिक २०१६ में१.७ लाख लोगों की मृत्यु हुई और एक भी रोगज़नक़ दुनिया भर में23द्वारा मौत का प्रमुख कारण है । 24चूहों,25, खरगोशों26 और गैर मानव रहनुमाओं27 तपेदिक अनुसंधान में सबसे प्रसिद्ध पशु मॉडल हैं, लेकिन प्रत्येक अपनी सीमाओं का सामना । गैर एम तपेदिक संक्रमण के मानव रहनुमा मॉडल मानव रोग सबसे निकट जैसा दिखता है, लेकिन इस मॉडल का उपयोग कर गंभीर नैतिक विचारों के कारण सीमित है । अन्य पशु मॉडल रोग विकृति को प्रभावित करता है कि एम. तपेदिक की मेजबान विशिष्टता द्वारा रुकावट हैं । शायद मॉडलिंग तपेदिक में सबसे बड़ा मुद्दा मानव रोग में संक्रमण और रोग के परिणामों की व्यापक स्पेक्ट्रम है: तपेदिक एक बहुत ही विषम रोग से लेकर अव्यक्त, सक्रिय और सक्रिय संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा है28 , जो पुन: पेश करने के लिए और मॉडल प्रयोग मुश्किल हो सकता है ।
माइकोबैक्टीरियम marinum M. तपेदिक के एक करीबी रिश्तेदार ८५% एमिनो एसिड पहचान29के साथ ~ ३,००० orthologous प्रोटीन के साथ है । M. marinum स्वाभाविक रूप से संक्रमित zebrafish उत्पादन granulomas, तपेदिक की पहचान, अपने आंतरिक अंगों में19,30. अन्य पशु मॉडलों के विपरीत तपेदिक अनुसंधान में इस्तेमाल किया, zebrafish कई वंश पैदा करता है, यह केवल एक सीमित स्थान की आवश्यकता है और महत्वपूर्ण बात, यह neurophysiologically है सबसे कम विकसित हड्डीवाला तपेदिक मॉडल उपलब्ध है । इसके अतिरिक्त, एम. marinum संक्रमण अव्यक्त संक्रमण का कारण बनता है, सक्रिय रोग या वयस्क zebrafish में माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण की भी नसबंदी बारीकी से मानव क्षय रोग के परिणामों के स्पेक्ट्रम की नकल उतार19, 31 , ३२. यहां, हम पेट गुहा में एम marinum इंजेक्शन द्वारा वयस्क zebrafish के प्रायोगिक तपेदिक मॉडल के लिए तरीकों का वर्णन और मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करने के लिए माइक्रोबैक्टीरियल भार और zebrafish से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मापने ऊतक के नमूने ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम एक qPCR आधारित अनुप्रयोग का वर्णन करने के लिए प्रयोगात्मक संक्रमित वयस्क zebrafish ऊतकों से निकाले डीएनए से माइक्रोबैक्टीरियल भार को मापने. इस आवेदन 16S-23S rRNA आंतरिक लिखित स्पेसर अनुक्रम४०के आसप?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को फिनिश सांस्कृतिक फाउंडेशन (H.L.), हेरा क्षयरोग फाउंडेशन (H.L., एल.-M.V., M.M.H., म. प्र.), फाउंडेशन ऑफ फिनिश एंटी-क्षयरोग एसोसिएशन (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen säätiö) (H.L., M.M.H., म. प्र.), Sigrid jusélius फाउंडेशन (म. प्र.), एमिल Aaltonen फाउण्डेशन (M.M.H.), जेन एण्ड Aatos Erkko फाउण्डेशन (म. प्र.) और फिनलैंड की अकादमी (म. प्र.). लीना mäkinen, हैना-लीना Piippo और Jenna ilomäki उनकी तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं. लेखक अपनी सेवा के लिए छेड़-छाड़ Zebrafish प्रयोगशाला मानते हैं.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
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