Summary

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Published: October 08, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para tuberculose humana de modelo em um adulto zebrafish usando seu patógeno natural Mycobacterium marinum. Extraído DNA e RNA de órgãos internos de zebrafish infectado podem ser usado para revelar que o total micobacteriana carrega no peixe e as respostas de imune do hospedeiro com qPCR.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis é atualmente o mais mortífero patógeno humano causando infecções 10,4 milhões e 1,7 milhões de mortes todos os anos. Exposição a esta bactéria faz com que um espectro largo de doença em seres humanos, que vão desde uma infecção esterilizada para uma doença mortal ativamente progredindo. A forma mais comum é a tuberculose latente, que é assintomática, mas tem o potencial para reativar a uma doença fulminante. Zebrafish adulto e seu patógeno natural Mycobacterium marinum recentemente provaram para ser um modelo aplicável para estudar o espectro de doença ampla de tuberculose. Importante, espontânea latência e reativação, bem como adaptáveis respostas imunes no contexto da infecção micobacteriana pode ser estudadas neste modelo. Neste artigo, descrevemos os métodos para a infecção experimental de zebrafish adulto, a coleção dos órgãos internos para a extração de ácidos nucleicos para a medição das cargas micobacterianas e acolhimento respostas imunes por PCR quantitativo. O in desenvolvido internamente, M. marinum –ensaio de qPCR específico é mais sensível que os métodos tradicionais de chapeamento como também detecta DNA de micobactérias não-dividindo, dormentes ou recentemente mortas. Como o DNA e o RNA são extraídos do mesmo indivíduo, é possível estudar as relações entre o estado doente e a expressão do gene hospedeiro e patógeno. O modelo adulto zebrafish para tuberculose, portanto, apresenta-se como um sistema altamente aplicável, não-mamíferos na vivo para estudar interações patógeno-hospedeiro.

Introduction

Peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal amplamente utilizado na investigação biomédica e é um modelo aceito para a biologia de vertebrados comum. O zebrafish foi adaptada a muitos campos de pesquisa modelagem de doenças humanas e desordens que variam de câncer1 e doença cardíaca2 a infecção e estudos imunológicos de várias bactérias 3 e infecções virais4 , 5. Além disso, o ex utero desenvolvimento de embriões de zebrafish fez o zebrafish um modelo popular em biologia do desenvolvimento-6 e toxicologia7,8.

Em muitos campos de investigação, incluindo a biologia da infecção, as larvas de zebrafish opticamente transparente são comumente usadas. As primeiras células imunes aparecem dentro fertilização post de 24 h (hpf), quando os macrófagos primitivos são detectados9. Os neutrófilos são as células imunitárias próximo a aparecer por volta de 33 hpf10. Zebrafish larvas são, portanto, viáveis para o estudo da fase inicial da infecção e o papel da imunidade inata na ausência de células do sistema imune adaptativo11. No entanto, o zebrafish adulto com seu totalmente funcional sistema imune adaptativo fornece uma camada adicional de complexidade para experimentos de infecção. Células T podem ser detectadas em torno de 3 dias pós fertilização12, e as células B são capazes de produzir anticorpos funcionais por 4 semanas pós fertilização13. O peixe-zebra adulto tem todas as principais contrapartes do mamífero sistema imune inato e adaptativo. As principais diferenças entre o immune systems de peixe e os seres humanos são encontradas no anticorpo isotipos, bem como a anatomia dos tecidos linfoides. O peixe-zebra tem anticorpo apenas três classes14, Considerando que os seres humanos têm cinco15. Na ausência de medula óssea e gânglios linfáticos, os órgãos linfoides primários no peixe são o rim e o Timo16 e o baço, o rim e o intestino servem como órgãos linfoides secundários17. Apesar dessas diferenças, com seu arsenal completo imune das células inatas e adaptativas, o zebrafish adulto é um modelo altamente aplicável, fácil de usar, não-mamíferos para estudos de interação patógeno-hospedeiro.

O zebrafish ultimamente foi estabelecido como um modelo viável de estudar tuberculose18,19,20,21,22. A tuberculose é uma doença no ar, causada pelo Mycobacterium tuberculosis. De acordo com a Organização Mundial de saúde, tuberculose causou1,7 milhões de mortes em 2016 e é a principal causa de morte por um patógeno único no mundo23. Os ratos24,25, coelhos26 e primatas não-humanos27 são que o animal mais conhecido modelos na pesquisa de tuberculose, mas cada rosto suas limitações. O modelo de primatas não humanos de M. tuberculosis infecção da doença humana assemelha-se mais intimamente, mas usar este modelo é limitado devido a considerações éticas graves. Outros modelos animais são prejudicados pela anfitrião-especificidade de M. tuberculosis que afeta a patologia da doença. Provavelmente o maior problema na modelagem de tuberculose é o amplo espectro de infecção e doença resultados na doença humana: a tuberculose é uma doença muito heterogênea, variando de esterilização imunidade a infecção latente, ativa e reativada28 , que pode ser difícil de reproduzir e modelo experimentalmente.

Mycobacterium marinum é um parente próximo do M. tuberculosis com proteínas de ortólogos ~ 3.000 com 85% de identidade de aminoácidos29. M. marinum naturalmente infecta zebrafish produzir granulomas, as principais características da tuberculose, em seus órgãos internos19,30. Ao contrário de outros modelos animais utilizados na pesquisa de tuberculose, zebrafish produz muitos filhos, requer apenas um espaço limitado e importante, neurophysiologically é o modelo de tuberculose vertebrados menos desenvolvido disponível. Além disso, a M. marinum infecção causa infecção latente, doença ativa ou mesmo esterilização da infecção micobacteriana no zebrafish adulto intimamente imitando o espectro dos resultados de doença da tuberculose humana19, 31 , 32. aqui, descrevemos os métodos para o modelo experimental de tuberculose de adultos do zebrafish injetando M. marinum na cavidade abdominal e usando PCR quantitativo para medir a cargas micobacterianas e respostas imunes de zebrafish amostras de tecido.

Protocol

Todos os experimentos de zebrafish foram aprovados pelo Conselho de experimento Animal na Finlândia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos são executados de acordo com a lei (497/2013) e do Decreto do governo (564/2013), relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos ou educacionais na Finlândia. 1. cultivo de Mycobacterium marinum Nota: Desde que o Mycobacterium marinum é um patógeno capaz de causar infecções superficiais nos sere…

Representative Results

O patógeno de peixe natural Mycobacterium marinum infecta os órgãos internos do peixe-zebra e produz uma infecção sistêmica com granulomas histologicamente visível19. Zebrafish adulto estão infectados com M. marinum por uma injeção intraperitoneal. O DNA e RNA são extraídos, e a carga de micobactérias é medida pela reacção em cadeia do polymerase quantitativa (qPCR) usando o DNA como o modelo. O contorno do método é mostrado na <…

Discussion

Aqui nós descrevemos uma aplicação baseada em qPCR para medir micobacterianas cargas de DNA extraído de tecidos de zebrafish adultos infectados experimentalmente. Este aplicativo é baseado em cartilhas projetadas em torno do 16S-23S rRNA espaçador transcrito interno sequência40. A carga total de micobactérias em uma amostra de peixes é estimada usando uma curva padrão preparada a partir de DNA extraído de um número conhecido de micobactérias culturas e assumindo que uma bactéria tem …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo finlandês Cultural Foundation (H.L.), Fundação de tuberculose de Tampere (H.L., L.-M.V., M.M.H, M.P.), Fundação da associação finlandesa de antituberculose (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H, M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (P.F.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H), Jane e Aatos Erkko Foundation (P.F.) e Academia da Finlândia (P.F.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo e Jenna Ilomäki são reconhecidos por sua assistência técnica. Os autores reconhecem o laboratório de Zebrafish de Tampere para seu serviço.

Materials

Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 ml homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

Referências

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  24. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  25. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  26. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  27. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  28. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  29. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  30. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
  31. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  32. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  33. Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  34. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
  35. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
  36. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  37. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  38. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  39. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  40. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  41. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  42. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  43. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
  44. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  45. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

Play Video

Citar este artigo
Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

View Video