Modellering tuberkulos i Mycobacterium marinum infekterade vuxna zebrafiskar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll till modell human tuberkulos i en vuxen zebrafiskar som använder dess naturliga patogen Mycobacterium marinum. Extraherad DNA och RNA från de inre organen av infekterade zebrafiskar kan användas för att avslöja totalen mykobakteriella laster i fisken och värdens immunsvar med qPCR.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis är för närvarande den dödligaste mänskliga patogener som orsakar 1,7 miljoner dödsfall och 10,4 miljoner infektioner varje år. Exponering för denna bakterie orsakar ett brett sjukdom spektrum hos människor alltifrån en steriliserad infektion till ett aktivt progredierande dödliga sjukdom. Den vanligaste formen är den latent tuberkulos, som är asymtomatiska, men har potential att återaktivera in en fulminant sjukdom. Adult zebrafiskar och dess naturliga patogen Mycobacterium marinum har nyligen visat sig vara en tillämpliga modell att studera brett sjukdom spectrumen av tuberkulos. Ännu viktigare, kan spontana latens samt reaktivering och adaptiva immunsvaret i samband med mykobakteriella infektioner studeras i denna modell. I den här artikeln beskriver vi metoder för experimentell infektion av vuxen zebrafiskar, insamling av inre organ för utvinning av nukleinsyror för mätning av mykobakteriella laster och värd immunsvar med kvantitativ PCR. Den i egenutvecklade, M. marinum –specifik qPCR-analys är känsligare än de traditionella plätering metoderna som också upptäcker DNA från icke-Division, vilande eller nyligen döda mykobakterier. Som både DNA och RNA extraheras från en och samma individ, är det möjligt att studera relationerna mellan tillståndet sjuka och värd och patogen-genuttrycket. Den vuxna zebrafisk modellen för tuberkulos således presenterar sig som ett starkt gällande, icke däggdjur i vivo -system för att studera värd-patogen interaktioner.
Introduction
Sebrafisken (Danio rerio) är en allmänt använd djurmodell i biomedicinsk forskning och det är en vedertagen modell för gemensamma ryggradsdjur biologi. Zebrafisk har anpassats till många forskningsområden modellering mänskliga sjukdomar och besvär i alltifrån cancer1 och hjärtsjukdom2 till infektion och immunologiska studier av flera bakteriella 3 och virusinfektioner4 , 5. Dessutom ex utero utveckling zebrafiskar embryon har gjort zebrafiskar en populär modell i utvecklingsbiologi6 och toxikologi7,8.
Inom många forskningsområden, inklusive infektionsbiologi, används vanligen optiskt genomskinliga zebrafiskar larverna. De första immuncellerna visas inom 24 h efter befruktning (hpf), när primitiva makrofager är upptäckta9. Neutrofiler är nästa immuncellerna ska visas runt 33 hpf10. Zebrafiskar larver är därmed genomförbara för att studera de tidiga stadierna av infektion och rollen av den medfödda immuniteten i avsaknad av adaptiv immunceller11. Men ger den vuxna zebrafiskar med dess fullt funktionella adaptiva immunsystemet ett extra lager av komplexitet för infektion experiment. T-celler kan upptäckas runt 3 dagar efter befruktning12och B-celler kan producera funktionella antikroppar av 4 veckor efter befruktning13. Den vuxna zebrafisk har alla de viktigaste motposter däggdjur medfödd och adaptiv immunsystemet. De viktigaste skillnaderna mellan immune systems fisk och människor finns i antikropp isotyper samt liksom anatomin av lymfvävnad. Zebrafisk har endast tre antikropp klasserna14, medan människor har fem15. I avsaknad av benmärg och lymfkörtlar, de primära lymfoida organ i fisken är njurarna och bräss16 och mjälten, njurarna och tarmen fungera som sekundära lymfoida organ17. Trots dessa skillnader, med dess fullständiga immun arsenal av medfödd och adaptiv celler, är de vuxna zebrafiskar en starkt gällande, lätt-till-använda, icke däggdjur modell för värd-patogen interaktionsstudier.
Zebrafisk har nyligen etablerat sig som en genomförbar modell för att studera tuberkulos18,19,20,21,22. Tuberkulos är en luftburen sjukdom som orsakas av Mycobacterium tuberculosis. Enligt Världshälsoorganisationen, tuberkulos orsakade1,7 miljoner dödsfall under 2016 och är den ledande dödsorsaken av en enda patogen världen över23. Möss24,25, kaniner26 och icke-mänskliga primater27 är den mest kända djuren modeller i tuberkulos forskning men varje ansikte sina begränsningar. Den icke-mänskliga primater modellen av M. tuberkulosinfektion liknar mänskliga sjukdomen närmast, men med denna modell är begränsad på grund av allvarliga etiska överväganden. Andra djurmodeller hindras av värd-specificitet M. tuberkulos som påverkar sjukdomen patologin. Förmodligen den största frågan i modellering tuberkulos är det breda spektrumet av infektioner och sjukdomar resultat i den mänskliga sjukdomen: tuberkulos är en mycket heterogen sjukdom som alltifrån sterilisering immunitet mot latent, aktiv och återaktiverade infektion28 , vilket kan vara svårt att reproducera och modell experimentellt.
Mycobacterium marinum är en nära släkting till M. tuberkulos med ~ 3000 orthologous proteiner med 85% aminosyra identitet29. M. marinum infekterar naturligt zebrafiskar som producerar granulom, kännetecken för tuberkulos, i dess inre organ19,30. Till skillnad från andra djurmodeller används i tuberkulos forskning, zebrafiskar producerar många avkommor, det kräver bara ett begränsat utrymme och ännu viktigare, det är neurophysiologically minst utvecklade ryggradsdjur tuberkulos modell tillgänglig. Dessutom orsakar M. marinum infektion latent infektion, aktiv sjukdom eller ens sterilisering av mykobakteriella infektioner i vuxen zebrafiskar noga härma spectrumen av sjukdom utfall av human tuberkulos19, 31 , 32. här, vi beskriver metoder för experimentell tuberkulos modellen av vuxen zebrafiskar genom att injicera M. marinum i bukhålan och med kvantitativ PCR för att mäta mykobakteriella laster och immunsvar från zebrafisk vävnadsprover.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en qPCR-baserat program för att mäta mykobakteriella laster från DNA extraheras från experimentellt infekterade vuxna zebrafiskar vävnader. Denna ansökan är baserad på primers utformad kring 16S-23S rRNA intern transkriberas spacer sekvens40. Den totala mykobakteriella belastningen i ett fisk-prov uppskattas med hjälp av en standardkurva beredd från DNA extraheras från ett känt antal odlade mykobakterier och förutsatt att en bakterie har ett exemplar av dess arvsmass…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har stötts av den finska kulturella Foundation (H.L.), Tammerfors tuberkulos Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Stiftelsen för Finlands mot tuberkulos (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius stiftelse (MP), Emil Aaltonens Foundation (M.M.H.), Jane och Aatos Erkkos stiftelse (MP) och Finlands Akademi (MP). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo och Jenna Ilomäki är erkända för sin tekniskt bistånd. Författarna erkänner Tammerfors zebrafiskar laboratoriet för sin tjänst.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
Referências
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
