Vævsmanipulering af hele bugspytkirtlen er en udfordring på grund af dens eksokrine og endokrine funktioner. Vi viser en metode til dissektion af en intakt svin bugspytkirtlen og processen af vellykkede decellularization af perfusion af detergenter Triton X-100, natrium deoxycholate og deoxyribonuclease.
Vævsmanipulering af hele bugspytkirtlen kan forbedre nuværende behandlinger for diabetes mellitus. Det ultimative mål er at væv ingeniør bugspytkirtlen fra en allogene eller xenogene kilde med humane celler. En demonstration af metoder til effektiv dissektion, decellularization og recellularization af svin bugspytkirtlen kan gavne feltet. Beslægtet med menneskets bugspytkirtel, svin bugspytkirtel har en særlig anatomisk ordning med tre kamre (milt, sår på tolvfingertarmen, og forbindelsen) afrundet af duodenum og tyndtarmen. Den duodenal lap af bugspytkirtlen tilsluttes duodenum ved flere små blodkar. Vævsmanipulering i bugspytkirtlen er kompliceret på grund af dens eksokrine og endokrine karakter. I dette papir vise vi en detaljeret protokol at dissekere hele svin bugspytkirtlen og decellularize det med vaske-og samtidig spare sin struktur og nogle ekstracellulære matrix komponenter. For at opnå komplet perfusion, er aorta valgt som indløb og portal vene som afsætningsmulighed. Andre blodkar (hepatisk arterie, milt vene, milt arterie, mesenterica arterie og vene træ) og galdegang er forbundet. For at forhindre dannelse af blodprop, grisen er heparinized, og straks efter dissektion, orglet er skyllet med koldt heparin. For at hæmme virkningen af eksokrine enzymer, ligger bugspytkirtlen decellularization på 4 ° C. Decellularization er udført af perfusion af Triton X-100, natrium deoxycholate og deoxyribonuclease, med en intermitterende og endelige omfattende vask. Med en vellykket decellularization, bugspytkirtlen vises hvide og en histologisk vurdering med hæmatoxylin og eosin viser en manglende kerner med en bevarede ekstracellulære matrixstruktur. Den foreslåede metode kan således bruges at dissekere og decellularize hele svin bugspytkirtlen.
Diabetes mellitus er karakteriseret ved tilstedeværelsen af øgede niveauer af glukose i blodet. Det er anerkendt som en større offentlige sundhedsudfordring i de fleste lande1. Høje niveauer af blodsukker påvirker blodkar og nervesystem, forårsager skader på øjnene, hjertet, og nyrer, og ekstremiteter iskæmi. Traditionelle metoder til behandling omfatter injektioner af eksogen insulin, medicin og livsstilsændringer. At se bort fra en kur for sygdommen, i nogle tilfælde, undlader tilgængelige behandlinger at vedligeholde insulin ved terapeutiske niveauer, hvilket resulterer i hyperglykæmi. Selv om transplantation af Holme eller hele bugspytkirtlen eliminerer sygdommen, er det ikke almindeligt gjort på grund af mangel på egnet donor organer og de risici og vanskeligheder fra immunosuppression og indkapsling2.
Nuværende forbedringer inden for tissue engineering og regenerativ medicin besidder evnen til at levere en løsning for disse problemer. Med en teknik, decellularization, den cellulære materiale fra mennesker eller dyr donor kan fjernes samtidig vigtigt ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, vækstfaktorer, og signalering molekyler er bevaret i skafottet. Sådanne stilladser kan potentielt blive transplanteret uden behov for immunosuppression, gendanne funktionen orgel efter recellularization med modtagerens egen ikke-immunogen stamceller3,4. Væv-manipuleret organer fra allogene eller xenogene kilder kan anvendes i klinisk transplantation, større ekstracellulære matrix proteiner er bevaret blandt arter og kan ikke afvises efter transplantation5.
Decellularization er et godt udforsket metode med en optimal udnyttelse af fysiske kræfter, kemiske rengøringsmidler og enzymer i en fysiologisk indstilling til at fjerne celler og nukleart materiale fra et væv eller organ. Recellularization er en procedure for såning celler tilbage i acellulær orgel. Det er et intellektuelt hård procedure, der kræver et stort antal celler, en optimal celle-seeding strategi og en bioreaktor system for kulturen i orgel på fysiologisk acceptable forhold som temperatur, tryk og gasser6.
Bugspytkirtlen kan betragtes som en udfordrende væv til vævsmanipulering på grund af sin eksokrine og endokrine kapacitet. De eksokrine væv udskiller flere fordøjelsesenzymer, mens den endokrine del udskiller hormoner, herunder insulin. Decellularization af intakt bugspytkirtel fra mus7,8, menneskelige9og gris10 er allerede blevet rapporteret ved hjælp af enzymer (trypsin, deoxyribonuclease [DNase]) og ikke-ionisk (Triton X-100) og ioniske detergenter ( natrium deoxycholate [SDC] og sodium dodecyl sulfat [SDS]). Men efter de publicerede protokoller, vi kæmpede med en vellykket dissektion og komplet perfusion og decellularization samtidig med at en ECM struktur. Vi spekulerede, at de anvendte rengøringsmidler under decellularization forårsage lysering af celler, dermed frigøre fordøjelsesenzymer ind i orglet. De frigivne enzymer vil medføre en uoprettelig skade på ECM stillads og gør det ineffektivt for decellularization og recellularization. Et design af den metode, der effektivt decellularizes bugspytkirtlen mens hæmme virkningen af fordøjelsesenzymer kan løse problemet. Vi valgte strategi af Peloso et al., af decellularization i bugspytkirtlen ved en kold temperatur, selv om de ikke rapportere om hvorfor kolde temperatur er brugt9. På samme tid, vi har designet en dissektion strategi med ændringer fra Taylor et al. ved at vælge aorta som en perfusion indløb over cøliaki stammen (CT) og den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie (SMA)11.
I en nylig offentliggjort artikel12viser vi en metode til effektiv isolation og decellularization af svin bugspytkirtlen samtidig bevare nogle ECM komponenter. I dette papir, vi viser en detaljeret beskrivelse af hvordan at dissekere en hele svin bugspytkirtlen indeholdende milt, sår på tolvfingertarmen, og forbindelsen lapper, og fremlægge en trinvis protokol for vellykket decellularization.
Den foreslåede protokol, ved hjælp af perfusion af SDC og Triton X-100 ved 4 ° C, vil decellularize hele svin bugspytkirtlen korrekt. Udfordringen i denne teknik er dissektion af intakt bugspytkirtlen indeholdende alle de tre kamre uden at beskadige parenkym samt dens formidlende fartøjer og ligatur af andre vaskulære grene af modellen for at perfuse orgel uden lækage. Svin bugspytkirtlen har en forskellige anatomi i forhold til den menneskelige bugspytkirtlen. Det består af tre lapper og forbliver i tæt kontakt med tyndtarmen ved dels omkring den. Vi dissekeret duodenum sammen med bugspytkirtlen, som flere små blodkar fra bugspytkirtlen forbinde tarmen. Under optimering studier, har stump skæring af disse blodkar vist lækage og en ufuldstændig perfusion af løsninger.
Da aorta forbinder til bugspytkirtlen gennem cøliaki og overlegne mesenteriallymfeknuderne arterierne, valgte vi aorta som en indgang til at holde perfusion enkle ved kun at bruge én kanyle og derfor et indløb. Vores erfaring, ligatur af aorta over CT og under SMA vil formindske tid af dissektion og reducerer risikoen for at beskadige nogen af de to skibe. Ud over en heparinized gris bemærket vi også, at en perfusion af kolde heparin via aorta umiddelbart efter dissektion hjælper med at opnå perfusion af løsninger i hele orglet. Vi spekulere, hvis dette sker ved at forebygge dannelsen af blodpropper i blodkarrene. Den indledende perfusion af en bugspytkirtlen med ultrarent vand efter dissektionen vil lyse røde blodlegemer og fjerne blod resterne i orgel, derved forhindrer dannelsen af blodpropper. Denne periode kan også bruges til at finde nogen unligated små grene af vener og arterier, som blodgennemstrømning kan være let bemærket ovenfor baggrunden.
Vi valgte at holde hele decellularization procedure ved kolde temperaturer (4 ° C), da dette vil hæmme virkningen af eksokrine enzymer, der frigive fra eksokrine celler i bugspytkirtlen. De eksokrine enzymer, når ikke hæmmet, kan forårsage en skadelig indvirkning på celler og ECM, som de kan fordøje cellemembraner og proteiner12. Som nedfrysning og optøning kan effektivt brast cellerne, indgår vi et fryse/tø skridt, i første omgang selv før perfusion af vaske-og rengøringsmidler4,13. Den første vask efter optøning vil fjerne resterne af celle brister. Vaskemiddel behandling vi brugt er en blanding af SDC og Triton X-100 på usædvanligt høje koncentrationer og med en høj perfusion hastighed. Vi har valgt denne tilgang til at opnå hurtigere decellularization ved at fjerne de eksokrine celler, der skader ECM. Vi spekulere, at en hård og hurtig protokol er til gavn for bugspytkirtlen decellularization, kortere tid vil være til rådighed for pancreas enzymer til at interagere med ECM, dermed bevare gode ECM komponenter. For at bevare ECM komponenter, tilføjet vi også Serin protease hæmmer (PMSF) til vaskemiddel-løsninger, som der vil hæmme aktiveringen af enzymer frigivet fra eksokrine celler14. Natriumazid er føjet til alle decellularization løsninger, da det fungerer som en bakteriostatisk agent, dermed hæmme risikoen for bakteriel forurening15.
Bugspytkirtlen decellularized efter denne protokol, viste en bevarelse af ECM strukturer og ECM proteiner kollagen og elastin. Men et betydeligt tab af glycosaminoglycans blev bemærket i decellularized bugspytkirtlen. Bugspytkirtlen decellularized på denne måde også viste lovende for fastgørelse af menneskelige føtal pancreas stamceller og udtryk for eksokrine og endokrine markører i stykker recellularized for 14 dage12. For at generere en intakt og funktionsdygtig bugspytkirtlen, kræves yderligere forskning i evaluere korrekte celle kilder, celletyper, celle seeding strategier og bioreaktor kultur.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev finansieret af et tilskud fra den svenske regering LUA ALF til S.S.H.
4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Suture | Vömel | 14817 | |
Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |