पूरे अग्ंयाशय के ऊतक इंजीनियरिंग अपनी exocrine और अंत में स्रावी कार्यों की वजह से एक चुनौती है । हम एक बरकरार सुअर का अग्ंयाशय के विच्छेदन और डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स-१००, सोडियम deoxycholate, और deoxyribonuclease के छिड़काव द्वारा सफल decellularization की प्रक्रिया के लिए एक विधि दिखाते हैं ।
पूरे अग्ंयाशय के ऊतक इंजीनियरिंग मधुमेह के लिए वर्तमान उपचार में सुधार कर सकते हैं । अंतिम लक्ष्य मानव कोशिकाओं के साथ एक allogeneic या xenogeneic स्रोत से ऊतक इंजीनियर अग्ंयाशय के लिए है । कुशल विच्छेदन, decellularization, और सुअर का अग्ंयाशय के recellularization के लिए विधियों का एक प्रदर्शन क्षेत्र को लाभ हो सकता है । मानव अग्ंयाशय के समान, सुअर का अग्ंयाशय तीन पालियों (प्लीहा, ग्रहणी, और कनेक्शन) ग्रहणी और छोटी आंत द्वारा गोल के साथ एक विशेष संरचनात्मक व्यवस्था है । अग्ंयाशय के ग्रहणी पालि कई छोटे रक्त वाहिकाओं द्वारा ग्रहणी को जोड़ता है । अग्न्याशय के टिशू इंजीनियरिंग इसकी exocrine और अंत में स्रावी प्रकृति की वजह से जटिल है । इस पत्र में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल दिखाने के लिए पूरे सुअर का अग्ंयाशय काटना और यह डिटर्जेंट के साथ decellularize जबकि इसकी संरचना और कुछ extracellular मैट्रिक्स घटकों को बचाने । पूरा छिड़काव प्राप्त करने के लिए, महाधमनी प्रवेश और आउटलेट के रूप में पोर्टल नस के रूप में चुना जाता है । अन्य रक्त वाहिकाओं (यकृत धमनी, प्लीहा नस, प्लीहा धमनी, mesenteric धमनी और शिरा पेड़) और पित्त नली ligated हैं । थक्का के गठन को रोकने के लिए, सुअर heparinized है और, विच्छेदन के तुरंत बाद, अंग ठंडे हेपरिन के साथ फ्लश है । exocrine एंजाइमों की कार्रवाई को बाधित करने के लिए, अग्ंयाशय decellularization 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया है । decellularization ट्राइटन एक्स के छिड़काव द्वारा किया जाता है-१००, सोडियम deoxycholate, और deoxyribonuclease, एक आंतरायिक और अंतिम व्यापक धुलाई के साथ । एक सफल decellularization के साथ, अग्ंयाशय सफेद दिखाई देता है, और hematoxylin और eosin के साथ एक ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन एक संरक्षित नाभिक मैट्रिक्स संरचना के साथ extracellular की अनुपस्थिति से पता चलता है । इस प्रकार, प्रस्तावित विधि सफलतापूर्वक काटना और decellularize पूरे सुअर का अग्ंयाशय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
मधुमेह रक्त में ग्लूकोज के स्तर में वृद्धि की उपस्थिति की विशेषता है । यह अधिकांश देशों में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चुनौती के रूप में पहचाना जाता है1. रक्त ग्लूकोज के उच्च स्तर रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंत्र को प्रभावित, आंखों को नुकसान के कारण, दिल, और गुर्दे, और उग्रवाद के ischemia. उपचार के पारंपरिक तरीकों exogenous इंसुलिन, दवाओं, और जीवन शैली में परिवर्तन के इंजेक्शन शामिल हैं । एक तरफ रोग के लिए एक इलाज लाना, कुछ मामलों में, उपलब्ध उपचार चिकित्सकीय स्तर पर इंसुलिन बनाए रखने में विफल, hyperglycemia में जिसके परिणामस्वरूप. हालांकि टाप या पूरे अग्ंयाशय के प्रत्यारोपण रोग समाप्त, यह आमतौर पर उपयुक्त दाता अंगों की कमी की वजह से नहीं किया है और जोखिम और प्रतिरक्षादमन और encapsulation2से जुड़े कठिनाइयों की वजह से ।
ऊतक इंजीनियरिंग और regenerative चिकित्सा के क्षेत्र में वर्तमान सुधार इन मुद्दों के लिए एक समाधान प्रदान करने के लिए क्षमता के अधिकारी । decellularization की तकनीक के साथ, एक मानव या पशु दाता से सेलुलर सामग्री हटाया जा सकता है, जबकि महत्वपूर्ण extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन, विकास कारकों, और संकेत अणुओं पाड़ में संरक्षित कर रहे हैं । इस तरह के पाड़ों संभावित प्रतिरक्षादमन के लिए आवश्यकता के बिना प्रत्यारोपण किया जा सकता है, प्राप्तकर्ता के अपने गैर immunogenic स्टेम सेल3,4के साथ recellularization के बाद अंग समारोह बहाल करने के लिए । allogeneic या xenogeneic स्रोतों से ऊतक इंजीनियर अंगों नैदानिक प्रत्यारोपण में इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रमुख extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन प्रजातियों के बीच संरक्षित कर रहे हैं और5प्रत्यारोपण के बाद अस्वीकार नहीं किया जा सकता है के रूप में.
Decellularization एक अच्छी तरह से पता लगाया है शारीरिक बलों, रासायनिक डिटर्जेंट, और एक शारीरिक सेटिंग में एंजाइमों के इष्टतम उपयोग को शामिल विधि एक ऊतक या अंग से कोशिकाओं और परमाणु सामग्री को दूर करने के लिए । Recellularization कोशिकाओं acellular अंग में वापस बोने की एक प्रक्रिया है । यह एक बौद्धिक कठिन प्रक्रिया है, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है, एक इष्टतम कोशिका बोने की रणनीति, और तापमान, दबाव की तरह शारीरिक रूप से स्वीकार्य शर्तों पर अंग की संस्कृति के लिए एक प्रतिक्रियात्मक प्रणाली, और6गैसों ।
अग्ंयाशय अपने exocrine और अंत में स्रावी क्षमता की वजह से ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक चुनौतीपूर्ण ऊतक माना जा सकता है । exocrine ऊतक कई पाचन एंजाइमों स्रावित करती है, जबकि अंत में स्रावी हिस्सा हार्मोन, इंसुलिन सहित स्रावित करती है । माउस से बरकरार अग्न्याशय की decellularization7,8, मानव9, और सुअर10 पहले से ही एंजाइमों का उपयोग रिपोर्ट किया गया है (trypsin, deoxyribonuclease [DNase]) और गैर ईओण (ट्राइटन एक्स-१००) और ईओण डिटर्जेंट ( सोडियम deoxycholate [एसडीसी] और सोडियम dodecyl सल्फेट [एसडीएस]) । हालांकि, प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद, हम एक सफल विच्छेदन और पूरा छिड़काव और decellularization के साथ संघर्ष करते हुए एक ECM संरचना को बनाए रखने । हम अटकलें लगाई कि कोशिकाओं के decellularization कारण lysis के दौरान लागू डिटर्जेंट, जिससे अंग में पाचन एंजाइमों को रिहा । जारी एंजाइमों ECM पाड़ के लिए एक अपरिवर्तनीय क्षति का कारण है और यह decellularization और recellularization के लिए अक्षम कर देगा । विधि का एक डिजाइन है कि प्रभावी ढंग से decellularizes अग्ंयाशय जबकि पाचन एंजाइमों की कार्रवाई बाधा समस्या का समाधान हो सकता है । हम Peloso एट अलकी रणनीति का फैसला किया, अग्ंयाशय के decellularization के एक ठंडे तापमान पर, हालांकि वे रिपोर्ट क्यों ठंड तापमान9इस्तेमाल किया जाता है पर नहीं था । एक ही समय में, हम टेलर एट अल से संशोधनों के साथ एक विच्छेदन रणनीति तैयार की coeliac ट्रंक (सीटी) और बेहतर mesenteric धमनी (SMA)11पर एक छिड़काव प्रवेश के रूप में महाधमनी का चयन करके ।
हाल ही में प्रकाशित एक लेख12में, हम प्रभावी अलगाव और सुअर का अग्ंयाशय के decellularization के लिए एक विधि का प्रदर्शन करते हुए कुछ ECM घटकों के संरक्षण । इस पत्र में, हम प्लीहा, ग्रहणी, और कनेक्शन पालियों युक्त एक पूरे सुअर का अग्ंयाशय काटना करने के लिए कैसे का एक विस्तृत वर्णन दिखाने के लिए, और सफल decellularization के लिए एक stepwise प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
प्रस्तावित प्रोटोकॉल, एसडीसी और ट्राइटन X-१०० के 4 डिग्री सेल्सियस पर छिड़काव का उपयोग कर, पूरे सुअर का अग्ंयाशय सफलतापूर्वक decellularize जाएगा । इस तकनीक में चुनौती पैरेन्काइमा और इसकी आपूर्ति वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना सभी तीन पालियों से युक्त बरकरार अग्न्याशय के विच्छेदन है, साथ ही नमूना के अन्य संवहनी शाखाओं के बंधाव के क्रम में अंग perfuse करने के लिए बिना रिसाव के । सुअर का अग्ंयाशय मानव अग्ंयाशय की तुलना में एक अलग शरीर रचना विज्ञान है । यह तीन पालियों के होते है और आंशिक रूप से यह आसपास के द्वारा छोटी आंत के साथ निकट संपर्क में रहता है । हम अग्ंयाशय के साथ ग्रहणी विदारक, कई छोटे रक्त वाहिकाओं के रूप में अग्ंयाशय से आंत कनेक्ट । अनुकूलन अध्ययन के दौरान, इन रक्त वाहिकाओं के कुंद काटने रिसाव और समाधान का एक अधूरा छिड़काव दिखाया गया है ।
महाधमनी coeliac और बेहतर mesenteric धमनियों के माध्यम से अग्न्याशय को जोड़ता है के बाद से, हम केवल एक छिड़काव का उपयोग करके सरल प्रवेशनी रखने के लिए एक प्रवेश के रूप में महाधमनी चुना है और, इसलिए, एक प्रवेश. हमारे अनुभव में, सीटी के ऊपर महाधमनी के बंधाव और SMA के नीचे विच्छेदन के समय में कमी होगी और दो जहाजों के किसी भी नुकसान का खतरा कम कर देता है । एक heparinized सुअर के अलावा, हम यह भी ध्यान दिया है कि महाधमनी के तुरंत बाद विच्छेदन के माध्यम से ठंड हेपरिन की एक छिड़काव अंग भर में समाधान के छिड़काव को प्राप्त करने में मदद करता है । हम अटकलें अगर यह रक्त वाहिकाओं में रक्त के थक्के के गठन को रोकने के द्वारा होता है । विच्छेदन के बाद ultrapure पानी के साथ एक अग्ंयाशय के प्रारंभिक छिड़काव लाल रक्त कोशिकाओं को लाइसे और अंग में रक्त के अवशेष को दूर करेगा, जिससे रक्त के थक्के के गठन को रोकने । इस अवधि में भी नसों और धमनियों की किसी भी unligated छोटी शाखाओं को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में रक्त प्रवाह आसानी से पृष्ठभूमि के ऊपर देखा जा सकता है ।
हम ठंड तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) पर पूरे decellularization प्रक्रिया रखने का फैसला, के रूप में यह exocrine एंजाइमों की कार्रवाई में बाधा होगी कि अग्ंयाशय के exocrine कोशिकाओं से जारी है । exocrine एंजाइमों, जब बाधा नहीं है, कोशिकाओं और ECM पर एक बचके प्रभाव पैदा कर सकता है, के रूप में वे कोशिका झिल्ली और प्रोटीन12पचा सकता है । के रूप में ठंड और गल प्रभावी ढंग से कोशिकाओं को फट सकता है, हम एक फ्रीज/गल कदम, शुरू में भी डिटर्जेंट4,13के छिड़काव से पहले शामिल थे । शुरुआती धुल के बाद गल जाने से कोशिका के फटने के अवशेष निकल जाएंगे. हम इस्तेमाल किया डिटर्जेंट उपचार असामांय रूप से उच्च सांद्रता पर और एक उच्च छिड़काव गति पर एसडीसी और ट्राइटन एक्स-१०० का मिश्रण है । ECM को नुकसान पहुंचाने वाली exocrine कोशिकाओं को हटाकर तेजी से decellularization हासिल करने के लिए हमने यह तरीका चुना । हम सोचते है कि एक कठिन और तेजी से प्रोटोकॉल अग्ंयाशय decellularization के लिए फायदेमंद है, के रूप में कम समय अग्नाशय एंजाइमों के लिए उपलब्ध हो जाएगा ECM के साथ बातचीत, इस प्रकार अच्छा ECM घटकों के संरक्षण । ECM घटकों को बनाए रखने के लिए, हम भी serine चिढ़ा अवरोध करनेवाला (PMSF) डिटर्जेंट समाधान के लिए कहा, के रूप में है कि exocrine कोशिकाओं14से जारी एंजाइमों के सक्रियकरण को बाधित करेगा । सोडियम azide सभी decellularization समाधान के लिए जोड़ा गया है, के रूप में यह एक बैक्टीरियोस्टेटिक एजेंट के रूप में कार्य करता है, जिससे जीवाणु संदूषण15की संभावना बाधा ।
इस प्रोटोकॉल निंनलिखित अग्ंयाशय ECM संरचनाओं और ECM प्रोटीन कोलेजन और elastin का संरक्षण दिखाया । हालांकि, glycosaminoglycans का एक महत्वपूर्ण नुकसान में देखा गया था विसेलुलर अग्ंयाशय । इस फैशन में इस अग्न्याशय में भी मानव भ्रूण अग्नाशय स्टेम कोशिकाओं के लगाव के लिए वादा दिखाया और 14 दिनों12के लिए recellular टुकड़ों में exocrine और अंत-स्रावी मार्करों की अभिव्यक्ति. हालांकि, एक बरकरार और कार्यात्मक अग्ंयाशय उत्पंन करने के लिए, और अनुसंधान सही सेल सूत्रों का मूल्यांकन करने में आवश्यक है, सेल प्रकार, सेल सीडिंग रणनीतियों, और प्रतिक्रियात्मक संस्कृति ।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन स्वीडिश सरकार LUA ALF से S.S.H. को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया
4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Suture | Vömel | 14817 | |
Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |