Isolering och Decellularization av en hela svin bukspottkörtel

Summary

Vävnadsteknik i hela bukspottkörteln är en utmaning på grund av dess exokrina och endokrina funktioner. Vi visar en metod för dissektion av en intakt svin bukspottkörteln och processen av lyckad decellularization av perfusion av rengöringsmedel Triton x-100, natriumdeoxikolat och deoxyribonuclease.

Abstract

Vävnadsteknik i hela bukspottkörteln kan förbättra nuvarande behandlingar för diabetes mellitus. Slutmålet är att vävnad ingenjör bukspottkörteln från en allogena eller xenogena källa med mänskliga celler. En demonstration av metoder för effektiva dissektion, decellularization och recellularization av svin bukspottkörteln kan gynna fältet. Besläktad med människors bukspottkörtlar, svin bukspottkörtlar har en speciell anatomiska arrangemang med tre lober (mjälten, duodenalsår, och anslutningen) rundade av tolvfingertarmen och tunntarmen. Den duodenal loben av bukspottkörteln ansluter till tolvfingertarmen flera små blodkärl. Vävnadsteknik i bukspottkörteln är komplicerade på grund av dess exokrina och endokrina natur. I detta papper visar vi ett detaljerat protokoll att dissekera hela svin bukspottkörteln och decellularize det med rengöringsmedel samtidigt spara dess struktur och vissa extracellulär matrix komponenter. För att uppnå fullständig perfusion, väljs aorta som inlopp och portalen ven som utlopp. Andra blodkärl (levern artär, mjälten ven, mjälten artär, mesenterica artär och ven träd) och gallgången är sammanskrivna. För att förhindra bildandet av tromb, grisen är hepariniserad och, omedelbart efter dissektion, orgeln spolas med kallt heparin. För att hämma effekten av exokrina enzymer, ligger den bukspottkörteln decellularization vid 4 ° C. Decellularization utförs av perfusion av Triton x-100, natriumdeoxikolat och deoxyribonuclease, med en intermittent och slutliga omfattande tvätt. Med en framgångsrik decellularization, bukspottkörteln visas vitt och en Histologisk undersökning med hematoxylin och eosin visar en frånvaro av atomkärnor med bevarade extracellulärmatrix struktur. Den föreslagna metoden kan således användas för att framgångsrikt dissekera och decellularize hela svin bukspottkörteln.

Introduction

Diabetes mellitus kännetecknas av förekomsten av förhöjda nivåer av glukos i blodet. Det är erkänt som en utmaning för stora folkhälsan i de flesta länder¹. Höga nivåer av blodsocker påverkar blodkärl och nervsystemet, orsakar skador på ögonen, hjärtat och njurarna och extremiteten ischemi. Traditionella behandlingsmetoder inkluderar injektioner av exogent insulin, läkemedel och livsstilsförändringar. Bortser från ett botemedel mot sjukdomen, i vissa fall, misslyckas tillgängliga behandlingar med att upprätthålla insulinet på terapeutiska nivåer, vilket resulterar i hyperglykemi. Även om transplantation av Langerhanska eller hela bukspottkörteln eliminerar sjukdomen, görs det vanligen inte på grund av en brist på lämplig donator organ och de risker och svårigheter som från immunsuppression och inkapsling².

Nuvarande förbättringar i fältet för tissue engineering och regenerativ medicin besitter kapaciteten för att tillhandahålla en lösning för dessa frågor. Med tekniken med decellularization, det cellulära materialet från människor eller djur givare kan tas bort medan de viktiga extracellulär matrix (ECM) proteinerna, tillväxtfaktorer, och signalmolekyler bevaras i ställningen. Sådana ställningar kan potentiellt transplanteras utan behov av immunsuppression, återställa organfunktion efter recellularization med mottagarens egen icke-immunogent stamceller^3,4. Vävnadstekniska organ från allogena eller xenogena källor kan användas i kliniska transplantationer, som de stora extracellulära matrix proteinerna bevaras bland arter och kan inte avvisas efter transplantation⁵.

Decellularization är en väl utforskade metod som innefattar ett optimalt utnyttjande av fysiska krafter, kemiska rengöringsmedel och enzymer i en fysiologisk miljö att ta bort celler och nukleärt material från en vävnad eller organ. Recellularization är ett förfarande för sådd celler tillbaka in acellulärt orgeln. Det är ett intellektuellt tuffa procedur, som kräver ett stort antal celler, en optimal cell-sådd strategi och en bioreaktor system för kulturen i orgeln vid fysiologiskt godtagbara förhållanden som temperatur, tryck och gaser⁶.

Bukspottkörteln kan anses vara en utmanande vävnad för vävnadsteknik på grund av dess exokrina och endokrina kapacitet. Exokrin vävnad utsöndrar flera matsmältningsenzymer, medan den endokrina delen utsöndrar hormoner, inklusive insulin. Decellularization av intakt bukspottkörtlar från mus^7,8, humant⁹och gris¹⁰ har redan rapporterats med hjälp av enzymer (trypsin, deoxyribonuclease [DNAS]) och icke-joniska (Triton x-100) och joniskt rengöringsmedel ( natriumdeoxikolat [SDC] och sodium dodecyl sulfate [SDS]). Dock efter publicerade protokollen kämpade vi med en framgångsrik dissektion och komplett perfusion och decellularization samtidigt som en ECM-struktur. Vi spekulerade att tillämpad tvätt under decellularization orsaka Lysering av cellerna, frigjort matsmältningsenzymer i organet. Enzymerna som är släppt kommer en irreversibel skada till ECM schavotten och göra det ineffektivt för decellularization och recellularization. En design av den metod som effektivt decellularizes bukspottkörteln samtidigt hämmande verkan av matsmältningsenzymer kan lösa problemet. Vi valde strategin att Peloso et al., av decellularization i bukspottkörteln på en kall temperatur, även om de inte rapporterade om varför kall temperatur är användas⁹. Samtidigt utformade vi en dissektion strategi med ändringar från Taylor et al. genom att välja aorta som en perfusion inlopp över den celiaki stammen (CT) och den överlägsna mesenterica artär (SMA)¹¹.

I en nyligen publicerad artikel¹²visar vi en metod för effektiv isolering och decellularization av svin bukspottkörteln samtidigt bevara vissa ECM komponenter. I detta papper, vi visar en detaljerad beskrivning av hur du dissekera en hela svin bukspottkörteln som innehåller mjälten, duodenalsår och anslutning lober, och presentera ett stegvis protokoll för framgångsrika decellularization.

Protocol

Dissektion av ett svin bukspottkörteln och decellularization proceduren presenteras här följa de etiska riktlinjerna för Göteborgs universitet. 1. beredning av Decellularization Set-up Använda 3 x 5 mm silikon tuber, ansluta i serien behållaren tvättmedel inloppet till pumpen peristalic och sedan till bukspottkörteln i orgeln kammare via degasser (se figur 1). Anslut en hanluer till den fria änden av röret i orgel kammare. Anslut med en annan 3 x 5 mm silikon tub orgel kammaren till den tvättmedel outlet behållare via den peristaltiska pumpen att samla perfunderade tvättmedel. Anslut en omärkt pipett 2 ml till de lediga ändarna av rören i tvättmedel inlopp behållare och rengöringsmedel outlet matförpackningar. Hålla hela upplägget vid 4 ° C. Figur 1: förberedelse av perfusion set-up. Med en 3 x 5 mm silikon tub, som visas i set-up, Anslut i serien behållaren tvättmedel inlopp till den peristaltiska pumpen, degasser och orgel kammare. De svarta pilarna visar flödesriktningen från tvättmedel inlopp behållare till orgel kammare. För tvättmedel utlopp, använda en annan 3 x 5 mm silikon tub och Anslut den orgel kammare via den peristaltiska pumpen till behållaren tvättmedel utlopp. Röda pilarna visar flödesriktningen från orgel kammare till behållare för rengöringsmedel utlopp. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 2. beredning av Decellularization lösningar Lösning 1 (fosfatbuffrad koksaltlösning [PBS]): lägga till 8 g natriumklorid (137 mM), 0,2 g (2,7 mM) kaliumklorid, 1,44 g natriumfosfat (10 mM) och 0.24 g (1,8 mM) kaliumfosfat 1 L ultrarent vatten och rör om tills upplöst. Justera pH till 7,4 med saltsyra (HCl). Totalt krävs 3,2 L denna lösning. Lösning 2 (PBS + heparin): till 1 L av lösning 1, tillsätt 3,4 mL heparin (17 internationella enheter [IE] / ml). Förbereda denna lösning färska och hålla det på is tills det blir kallt. Sammanlagt krävs 1,2 L denna lösning. Lösning 3 (ultrarent vatten + natriumazid + dinatriumfosfatdihydrat etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt [EDTA]): till 1 L ultrarent vatten, tillsätt 1,86 g (5 mM) EDTA och 200 mg (0,02%) natriumazid. Rör tills salter löses. Kyl lösningen på 4 ° C före användning. Totalt krävs 22 L denna lösning. Lösning 4 (PBS + natriumazid + EDTA): till 1 L av lösning 1, lägga till 200 mg (0,02%) natriumazid och 1,86 g (5 mM) EDTA. Rör tills salter löses. Kyl lösningen på 4 ° C före användning. Totalt krävs 1 L denna lösning. Lösning 5 (ultrarent vatten + natriumazid): till 1 L ultrarent vatten, lägga till 200 mg (0,02%) natriumazid. Rör tills salter löses. Kyl lösningen på 4 ° C före användning. Totalt krävs 260 L denna lösning.Obs: EDTA bildar en fällning med SDC och uteslöts från lösning 5 eftersom det kommer att användas för omedelbar tvätt före och efter SDC behandling. Lösning 6 (SDC + Triton x-100): 940 mL av ultrarent vatten, tillsätt 40 g (4%) SDC, 60 mL (6%) Triton x-100, 200 mg (0,02%) natriumazid och 69,6 mg (0,4 mM) phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF). Rör tills upplöst. Kyl lösningen på 4 ° C före användning. Lägg till PMSF före användning. Totalt krävs 9,6 L denna lösning. Lösning 7 (DNase): Lägga till 10.000 Kunitz enheter av DNAS-I i 250 mL (40 Kunitz enheter/mL) Dulbecco’s PBS med CaCl2 och MgCl2. Förbereda färska och Använd omedelbart. Värm lösningen till 37 ° C före användning. Lösning 8 (PBS + natrium natriumazid): till 1 L av lösning 1, lägga till 200 mg (0,02%) natriumazid. Rör tills salter löses. Kyl lösningen på 4 ° C före användning. Totalt krävs 1 L denna lösning. 3. dissekering av svin bukspottkörteln Obs: I denna studie svin bukspottkörtlar var dissekerade från euthanized, hepariniserad (400 IE/kg) kvinnliga svin som väger 45 kg från en gård. Placera grisen på tabellen dissektion i ryggläge. Gör en mittlinjen snitt från xiphoidal processen till blygdbenet (ca 40 cm) med en skalpell utsätta alla bukorganen. Leta upp den mjälten, duodenalsår, och anslutningen lober. Leta upp nivån på de stora tolvfingertarmen papilla och ligera tolvfingertarmen muntligen från webbplatsen med två separata suturer. Ligera sämre matstrupen med två separata suturer och skär mellan de ligaturer med sax för att ta magen ut. Separata bindväv från tjocktarmen att nå tunntarmen. Separera det connective silkespappret av tjocktarmen som fäster på mjälten LOB i bukspottkörteln. Ta bort tjocktarmen från tunntarmen efter ligating artärer. Hitta den sämre mesenteriska ven och trädet sämre mesenterica artär och ligera med en sutur där de visas caudally i bukspottkörteln. Ligera mjälten artär och ven tillsammans med en sutur, nära mjälte, i hilum, och skär distalt med sax för att ta bort mjälten. Följ tolvfingertarmen tills duodenal och anslutning loberna är avmarkerade och ligera tolvfingertarmen i slutet med två separata suturer. Dissekera portalen ven, ligera det med en sutur att förhindra läckage blod från levern och skär proximalt till ligatur. Portalen ven fungerar som ett uttag under decellularization. Dissekera och ligera den gallgången och hepatiska artären med två suturer. Skär distalt till suturer. Hitta aorta under njurvenen och dissekera det i kranial riktning från muskler och bindväv tills den når området bukspottskörteln. Vänd bukspottkörteln försiktigt och dissekera aorta, hålla SMA och CT intakt, och skär aorta överlägsen CT och underlägsen SMA med sax. Skär resterande omgivande vävnader med sax och teckna bukspottkörteln. Med en 50 mL spruta ansluten till 4 mm arteriotomin kanyl, spola orgeln genom aorta med lösning 2 tills det perfuses hela orgeln eller hela orgeln blir kall. 4. beredning av svin bukspottkörteln för Decellularization Håll bukspottkörteln vid 4 ° C eller på isen under hela processen. Skär suturerna i tolvfingertarmen med sax, rengör det av mat genom spolning 50-150 mL ultrarent vatten med 25 mL pipett och ligera det igen med suturer. Ligera ena änden av aorta och alla grenar förutom SMA och CT med suturer för att förhindra läckage. Infoga från andra änden av aorta en 4 mm arteriotomin kanyl och ligera det med suturer. BEGJUTA bukspottkörteln med lösning 3 för 1 h vid 20 mL/min med decellularization set-up.Obs: Prefill rören av pumpen med lösning 3 så att inga bubblor ange bukspottkörteln. Leta efter eventuella läckage från alla sidor av orgeln och ligera alla öppna vaskulär grenar med suturer, utom portalen ven. Frysa bukspottkörteln vid-20 ° C i lösning 4 fram till början av decellularization. 5. decellularization i svin bukspottkörteln Tina bukspottkörteln vid 4 ° C. Köra den peristaltiska pumpen i decellularization set-up med lösning 3 20 mL/min tills inga luftbubblor ses i tvättmedel inlopp röret. Placera bukspottkörteln i behållaren decellularization och Anslut tvättmedel inlopp röret till aorta i bukspottkörteln. Tvätta orgeln av perfusion med lösning 3 övernattning på 20 mL/min vid 4 ° C. Häll ut den lösning kvar i orgel kammaren. Ersätta lösning 3 med lösning 5 och BEGJUTA bukspottkörteln i 30 min på 20 mL/min vid 4 ° C. Häll ut lösningen i orgel kammaren. Lägg till lösning 6 och BEGJUTA bukspottkörteln för 8 h vid 20 mL/min vid 4 ° C. Häll ut lösningen i orgel kammaren. Tvätta orgeln av perfusion med lösning 5 för 96 h på 20 mL/min vid 4 ° C. Häll ut lösningen i orgel kammaren. Förbereda bukspottkörteln DNAS behandling genom recirkulerande 500 mL Dulbecco’s PBS med CaCl2 och MgCl2 i 30 minuter vid 37 ° C. Häll ut lösningen i orgel kammaren. Tillsätt 250 mL lösning 7 och BEGJUTA bukspottkörteln för 4 h på 20 mL/min vid 37 ° C. Häll ut lösningen i orgel kammaren. Tvätta orgeln av perfusion med lösning 5 för 120 h på 20 mL/min vid 4 ° C. Lagra orgeln i lösning 8 vid 4 ° C under korta perioder eller vid-20 ° C under långa perioder. 6. kontroll av Decellularization Med sax, klipp 3 – till 10-mm biopsier från alla lober i bukspottkörteln och fixa dem i formaldehyd för 48 h i rumstemperatur. Tvätta bitarna i ultrarent vatten under 15 minuter, bearbeta dem i en vävnadsprocessor efter standardprotokoll och bädda in dem i paraffin. Skär 5 µm sektioner med mikrotomen och färga dem av Meyers hematoxylin och 0,2% alkohol eosin (han) efter standardprotokoll. Visa bilderna i ljus Mikroskop för att kontrollera för förlusten av atomkärnor.Obs: En bit från en färsk vävnad behandlas på samma sätt kan användas som en kontroll för att kontrollera förekomsten av atomkärnor.

Representative Results

Representativa svin bukspottkörteln dissektion bilderna, som kan bidra till att lokalisera och dissekera den sämre mesenterica artären och ven träd, portalen ven, den hepatiska artären, gallgången och aorta förgrenar CT och SMA, visas i figur 2A, 2boch 2 C (gula pilar), respektive. Figur 3A visar brutto morfologi av en normal bukspottkörtel, som visas ljus rosa och innehåller mjälten, anslutning och duodenal lober. Efter decellularization, den rosa färgen är förlorad och cell-lösa bukspottkörteln ser blek vit i färgen. Brutto morfologi bilden visar mjälten, visas anslutning och duodenal lober i en cell-lösa bukspottkörteln i figur 3B. Figur 3 c visar förekomsten av många blå kärnor i en normal bukspottkörtel genom färgning med han. I en cell-lösa bukspottkörteln, att han färgning visade en förlust av kärnor, eftersom ingen blå kärnor ses (figur 3D). Figur 2: bilder av ett svin bukspottkörteln dissektion. (A) platsen för sämre mesenterica artär och ven trädet (gul pil). (B) ligering av portalen ven, den hepatiska artären och gallgången (gul pil). (C) Aorta förgrenar den celiaki stammen och den överlägsna mesenterica artären (gul pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: brutto morfologi och han färgning av normala och cell-lösa bukspottkörtlar. (A) brutto morfologi av en normal bukspottkörtel. (B) brutto morfologi i en cell-lösa bukspottkörteln. (C) han färgning visar förekomsten av blå kärnor i en normal bukspottkörtel. (D) han färgning visar avsaknad av blå kärnor i en cell-lösa bukspottkörtel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det föreslagna protokoll, använder perfusion av SDC och Triton x-100 vid 4 ° C, kommer att decellularize hela svin bukspottkörteln framgångsrikt. Utmaningen i denna teknik är dissektion av intakt bukspottkörteln som innehåller alla tre loberna utan att skada parenkymet och dess levererande fartyg, samt ligering av andra vaskulära grenar av preparatet för att BEGJUTA orgeln utan läckage. Svin bukspottkörteln har en annan anatomi jämfört med mänskliga bukspottkörteln. Den består av tre lober och stannar i nära kontakt med tunntarmen genom delvis omger den. Vi dissekerade tolvfingertarmen tillsammans med bukspottkörteln, som flera små blodkärl från bukspottkörteln ansluter tarmen. Under optimering studier visat trubbiga skärning av dessa blodkärl läckage och en ofullständig perfusion av lösningar.

Eftersom aorta ansluter till bukspottkörteln genom celiaki och överlägsen mesenterica artärerna, valde vi aorta som ett inlopp att hålla perfusionen enkelt genom att bara använda en kanyl och, därför, ett inlopp. I vår erfarenhet, ligatur av aorta ovanför CT och under SMA kommer att minska tiden för dissektion och minskar risken för att skada någon av de två fartyg. Förutom en hepariniserad gris märkte vi också att en genomblödning av kall heparin via aorta omedelbart efter dissektion hjälper att uppnå perfusion av lösningar i orgeln. Vi spekulerar i om detta inträffar genom att förhindra bildandet av blodproppar i blodkärlen. Inledande perfusionen i en bukspottkörtel med ultrarent vatten efter dissekering kommer att lysera röda blodkroppar och ta bort blodet resterna i orgeln, därmed förhindra bildandet av blodproppar. Denna period kan också användas att hitta någon unligated små grenar av vener och artärer, som blodflödet kan enkelt märkas över bakgrunden.

Vi valde att hålla det hela decellularization förfarandet vid kalla temperaturer (4 ° C), eftersom detta kommer att hindra effekten av exokrina enzymer som släpper från exokrina celler i bukspottkörteln. De exokrina enzymerna, när inte hämmade, kan orsaka en skadlig effekt på cellerna och ECM, som de kan smälta cellmembran och proteiner¹². Som frysning och upptining kan effektivt spricker cellerna, ingick vi ett frysas och tinas steg, inledningsvis även innan perfusionen i tvättmedel^4,13. Den första tvätten efter upptining tar bort resterna av cell skurar. Rengöringsmedel behandling vi använde är en blandning av SDC och Triton x-100 vid ovanligt höga koncentrationer och en hög perfusion hastighet. Vi valde denna metod att uppnå snabbare decellularization genom att ta bort de exokrina celler som skadar ECM. Vi spekulerar att en hård och snabb protokoll är fördelaktigt för bukspottkörteln decellularization, som mindre tid blir tillgängliga för pankreasenzymer att interagera med ECM, därmed bevara bra ECM komponenter. För att bevara de ECM komponenterna, vi också till serin proteashämmare (PMSF) tvättmedel lösningarna, som som hämmar aktiveringen av enzymer frigörs från exokrina celler¹⁴. Natriumazid läggs till alla decellularization lösningar, som fungerar som en bakteriehämmande agent, och hämmar därigenom risken för bakteriell kontamination¹⁵.

Bukspottkörteln cell-lösa efter detta protokoll som visade ett bevarande av ECM strukturer och ECM proteinerna kollagen och elastin. Dock märktes en betydande förlust av glykosaminoglykaner i cell-lösa bukspottkörteln. Bukspottkörteln cell-lösa på detta sätt visade också löfte för fastsättning av mänskliga foster bukspottskörteln stamceller och uttrycket av exokrina och endokrina markörer i bitar som recellularized för 14 dagar¹². Generera en intakt och funktionella bukspottkörteln, krävs dock ytterligare forskning i utvärdera rätt cell källor, celltyper, cell sådd strategier och bioreaktor kultur.

Materials

4mm DLP arteriotomy cannula	Medtronic	31104
2ml Unlabelled pipette	vWR	612-3720
Degasser	Biotech AB	0001-6484
DNase-I	Worthington	LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2	Sigma Aldrich	D8662
EDTA disodium salt dihydrate	AlfaAesar	A15161.OB
Heparin	Leo	387107
Luer Male with 1/8" ID Barb	Oina	LM-2PP-QC	For 3X5mm silicon tube
Peristaltic pump	Oina	SP-1X4
PMSF	Roche	10837091001	Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Potassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich	P9791
SDC	Sigma Aldrich	30970
Silicon tube 3X5mm	VWR	2280706
Sodium Azide	Sigma Aldrich	71290
Sodium chloride	Sigma Aldrich	13423
Sodium hydrogen phosphate	Merck	71640-M
Suture	Vömel	14817
Syrringe 50mL	Becton Dickinson	300137
Triton-X-100	AlfaAesar	A16046.OF