تحليلاً تخليق البروتين البربخيه وإفراز
Summary
هنا، نحن تقرير توطين الفلورة دينامين لتوضيح البروتوكولات للكشف عن البروتينات في الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين الماوس وتلك الخلية البربخيه مخلدة خط (mECap18). ونحن أيضا وصف البروتوكولات من أجل عزل البروتينات الافرازية من السوائل البربخيه وخلية مكيفة وسائل الإعلام.
Abstract
البربخ الثدييات يولد واحد من السوائل intraluminal أعقد من أي الغدة الصماء بغية دعم الخصية بعد نضوج وتخزين المني. وينشأ هذا التعقيد نظراً لنشاط الخلايا الظهارية بطانة افرازية والاستيعابية مجتمعة. هنا، يمكننا وصف تقنيات لتحليل البروتين البربخيه وإفراز بالتركيز على نموذج الأسرة البروتين من ميتشانوينزيميس دينامين (الإدارة)؛ جتباسيس الكبيرة التي لديها إمكانات لتنظيم الاتجار الأحداث غشاء ثنائي الاتجاه. لدراسة التعبير البروتين في الأنسجة البربخيه، يمكننا وصف منهجية قوية لوسم الفلورة البروتينات المستهدفة في أقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين والكشف عن اللاحقة للتوزيع المكاني لهذه البروتينات عن طريق مجهر الفلورة. ونحن أيضا وصف المنهجية الأمثل لعزل وتوصيف اكسوسومي مثل حويصلات، المعروفة باسم ابيديديموسوميس، وهي تفرز في التجويف البربخيه للمشاركة في الاتصالات بين الخلايا مع نضوج الخلايا المنوية. كنهج تكميلي، يصف لنا أيضا كشف الفلورة البروتينات المستهدفة في خط خلية الظهارية البربخيه (mECap18) نصيب خلد SV40 ماوس. وعلاوة على ذلك، فإننا نناقش الأداة خط الخلية mECap18 كنموذج مناسب في المختبر لاستكشاف تنظيم نشاط افرازي البربخيه معها. لهذا الغرض، يصف لنا تثقيف متطلبات الصيانة خط الخلية mECap18 واستخدام أنظمة انتقائية تثبيط الدوائية القادرة على التأثير على بروتين افرازي الشخصية. سهولة تقييم هذه الأخيرة عن طريق الحصاد مكيفة الثقافة المتوسطة، وتركيز البروتينات يفرز عن طريق ترسيب حمض التريكلوروسيتيك/الأسيتون وتحليلها لاحقاً عبر الحزب الديمقراطي الصربي صفحة و immunoblotting. نؤكد أن هذه الأساليب مجتمعة مناسبة لتحليل الأهداف البديلة البروتين البربخيه تمهيدا لتحديد دورها الوظيفي في نضوج الحيوانات المنوية و/أو تخزين.
Introduction
المني من جميع أنواع الثدييات اكتساب القدرة على عرض الحركة التقدمية إلى الأمام وتسميد البويضة خلال تلك النسب المطول عن طريق البربخ، منطقة متخصصة للغاية من النظام الذكور مجرى الهواء خارج الخصية، التي قد 7-14 يوما للتنقل (تبعاً للأنواع الأحيائية)1. بسبب التكثيف الشديد من الكروماتين الأب وسفك معظم السيتوبلازم الذي يصاحب سيتوديفيرينتييشن المني في الخصيتين، مدفوعة نضج الفنية اللاحقة حصرا بتفاعلها مع المكروية البربخيه. هذا الوسط، يخلق بدوره، بنشاط سوما البربخيه بطانة افرازية والاستيعاب ويعرض مستوى استثنائي من تباين الجزء-الجزء1. وهكذا، الجزء الأكثر نشاطا من حيث البروتين وإفراز تلك الواقعة في الجزء الأقرب من البربخ (أي نصيب الفرد والاحضار)2. هذا النشاط يعكس الشخصية الوظيفية للمني، مع بداية أول الخلايا لعرض السمات المميزة للاختصاص الوظيفي (أي.، الحركة التقدمية، والقدرة على ربط حمض سولوبيليزيد زونا glycoproteins) التالية على المرور عبر البربخ نصيب3. هذه السمات الفنية مواصلة تطوير قبل الوصول إلى المستويات المثلى كما الحيوانات المنوية تصل إلى الجزء البربخيه القاصي (كودا)، حيث يتم تخزينها في حالة هادئة في الاستعداد للقذف. تكوين وصيانة هذا الخزان في تخزين الحيوانات المنوية يرتبط ارتباطاً وثيقا أيضا ظهارة بطانة، التي يهيمن عليها النشاط الاستيعابية قوية4،5في كودا. رغم الاختلافات التشريحية عنها6،،من78، يبدو أن هذه الشعبة أقاليميا للعمل سمة من سمات البربخ مشترك بين معظم أنواع الثدييات ودرس بالتاريخ، بما في ذلك الخاصة بنا9،10. في الواقع، من وجهة نظر سريرية، فمن المعروف أن الخلل البربخيه يجعل مساهمة هامة إلى المسببات عامل الذكور العقم11، ومن ثم تسليط الضوء على أهمية فهم تنظيم هذه الأنسجة المتخصصة.
ولذلك فمن المؤسف أن فهمنا البربخيه علم وظائف الأعضاء، والآليات التي تنظم مراحل متتابعة لنضوج الحيوانات المنوية وتخزينها داخل هذا النسيج، لا يزال يتم حلها بالكامل. من بين العوامل المساهمة، هي تحد من التقدم في البحوث البربخيه الشاملة تعقد هذا النسيج ومعرفة الآليات التي تمارس التحكم به المكروية لومينال التنظيمية. تشريحيا، ونحن نعلم أن وراء تمييز شرائح نصيب والاحضار وكاودا، يمكن تقسيم في البربخ كذلك إلى عدة مناطق (الشكل 1A)، كل فصل بواسطة سيبتا12 وتتميز بالتشكيلات الجانبية منفصلة من الجينات/البروتين التعبير13،،من1415،16،،من1718. في الواقع، على أساس مفصلة النسخي التنميط التعبير الجيني القطاعي في البربخ وأبلغ ما يصل إلى 6 و 9 مناطق البربخيه متميزة في نماذج الماوس وفار، على التوالي19،20. هذا التعقيد يفترض أن يعكس تكوين سوما البربخيه، ظهارة بسيودوستراتيفيد تتألف من العديد من أنواع الخلايا المختلفة؛ كل اختلاف فيما يتعلق بأنشطتها الوفرة والتوزيع والافرازيه/الاستيعاب على طول المسالك. وهكذا، هي الخلايا الرئيسية حتى الآن الأكثر وفرة خلية البربخيه نوع التي تشكل ما يزيد عن 80 في المائة من كافة الخلايا الظهارية. وبناء على ذلك، الخلايا الرئيسية المسؤولة عن الجزء الأكبر من البروتين البربخيه الحيوي وإفراز5. وفي المقابل، السكان الخلية واضحة، وهي مرتبة حسب نوع الخلية الثانية الأكثر وفرة داخل سوما البربخيه، أساسا تشارك في انتقائية امتصاص مكونات لومينال وتحمض هذا المكروية5. إضافة مستوى آخر من التعقيد، الاندروجين وغيرها من العوامل لوميكريني من أصل الخصية تمارس سيطرة التفاضلية على كل نوع من أنواع هذه الخلية البربخيه اعتماداً على تحديد المواقع على طول المسالك.
على الرغم من القيود التي تفرضها هذه الدرجة من التعقيد، تواصل نجاحات كبيرة إلى حل أساس الميكانيكية للدالة البربخيه. مفتاح لهذه الدراسات تم تطبيق استراتيجيات متقدمة الطيف الكتلي لإنشاء قوائم جرد واسعة النطاق من البروتين البربخيه، بالترادف مع تحليلات مفصلة للبروتينات الفردية يختارون من بين هذه الدراسات الأولية. مثال على هذا النهج هو لدينا توصيف الأخيرة لعائلة ميتشانوينزيميس في نموذج الفأر21ازدحاما. كان يغذيها اهتمامنا الأولى ازدحاما العمل المزدوج في الاقتران أكسو-والعمليات اندوسيتوتيك. وبناء على هذه الملاحظات، كنا قادرين على إثبات أن isoforms المتعارف عليه ثلاثة من ازدحاما (DNM1-DNM3) أعرب عن درجة عالية في البربخ الماوس والمتمركزة على النحو المناسب للوفاء بأدوار تنظيمية في إفراز البروتين وامتصاص21 . وعلاوة على ذلك، كنا قادرين على التمييز بوضوح كل isoform ازدحاما على أساس بهم التعريب الخلوية ودون الخلوية، مما يشير إلى أن لديهم متكاملة، بدلاً من نشاط زائدة عن الحاجة، داخل ظهارة البربخيه21.
وهنا، يمكننا وصف المنهجية التجريبية المستخدمة لدراسة التعبير ازدحاما في البربخ الماوس مع الأمل في أن هذه المعلومات سوف تجد تطبيقها على نطاق أوسع في توصيف البروتينات البربخيه البديلة والمساهمة بالتالي في موقعنا فهم وظيفة هذا العنصر الهام من المسالك التناسلية الذكور. على وجه التحديد، يمكننا وصف وضع منهجية قوية لوسم الفلورة البروتينات المستهدفة في الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين والكشف عن اللاحقة للتوزيع المكاني لهذه البروتينات عبر الفلورة الفحص المجهري. ونحن كذلك الوثيقة بروتوكولات مؤخرا الأمثل لدينا22 لعزل وتوصيف ابيديديموسوميس؛ حويصلات اكسوسومي مثل الصغيرة التي تشكل العناصر الرئيسية للشخصية الافرازية البربخيه والاحتفاظ بدور بارز في تعزيز نضوج الحيوانات المنوية23على ما يبدو. كنهج تكميلي، ونحن أيضا وصف الفلورة الكشف عن البروتينات المستهدفة في خط خلية الظهارية البربخيه (mECap18) نصيب مخلدة ماوس واستخدام هذا المورد كنموذج لاستكشاف تنظيم البربخيه نشاط افرازي في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
أدرجت هذه الدراسات استخدام الأنسجة في بوين البربخيه الثابتة التي تعرضت لتضمين البارافين والبروتوكولات القياسية تقطيع. الحل مثبت في بوين تضم خليط من فورمالدهايد وحمض البكريك وحمض الخليك، مع كل مكون من مكونات لها وظيفة محددة ومتكاملة. وهكذا، والفورمالديهايد يتفاعل مع الأمينات الأولية لت?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون الاعتراف بالصحة الوطنية والطبية أبحاث المجلس من أستراليا المشروع منحة APP1103176 لدعم هذا العمل.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
Referências
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf’s thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
- Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell’Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
