Analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et sécrétion
Summary
Nous rapportons ici, la localisation de l’immunofluorescence de dynamine pour illustrer les protocoles pour la détection des protéines dans les sections dans l’épididyme de paraffine souris et ceux d’une lignée de cellules épididymaires immortalisé (mECap18). Nous décrivons également les protocoles pour l’isolement des protéines sécrétoires du fluide épididymaire et milieux cellulaires conditionné.
Abstract
L’épididyme mammifères génère l’un des fluides intraluminal plus complexes de toute glande endocrine afin de favoriser la maturation post-testiculaire et le stockage des spermatozoïdes. Une telle complexité se pose en raison de l’activité combinée de sécrétion et d’absorption des paroi des cellules épithéliales. Nous décrivons ici les techniques pour l’analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et de la sécrétion en mettant l’accent sur la famille de protéine modèle de dynamine (DNM) mechanoenzymes ; grand GTPases qui ont le potentiel pour réglementer les événements trafic bidirectionnel membrane. Pour l’étude de l’expression des protéines dans les tissus dans l’épididyme, nous décrivons une méthodologie robuste pour l’immunofluorescence étiquetage des protéines cibles dans les sections de paraffine et la détection ultérieure de la distribution spatiale de ces protéines via la microscopie en immunofluorescence. Nous décrivons également méthodologie optimisée pour l’isolement et la caractérisation de l’exosome comme des vésicules, appelée epididymosomes, qui sont sécrétés dans la lumière dans l’épididyme de participer à la communication intercellulaire avec la maturation des spermatozoïdes. Comme une approche complémentaire, nous décrivons également la détection par immunofluorescence des protéines cibles dans une lignée de cellules épithéliales dans l’épididyme (mECap18) souris SV40-immortalisé caput. En outre, nous discutons de l’utilité de la lignée cellulaire de mECap18 comme un modèle approprié in vitro permettant d’étudier la régulation de l’activité sécrétrice épididymaire. À cette fin, nous décrivons les exigences de culture pour le maintien de la lignée cellulaire de mECap18 et de l’utilisation des schémas d’inhibition pharmacologique sélective qui sont capables d’influer sur leur profil de protéine sécrétoire. Ces derniers sont facilement évalués par le biais de la cueillette de milieu de culture conditionné, la concentration des protéines sécrétées par l’intermédiaire de précipitation de l’acide trichloroacétique et d’acétone et leur analyse ultérieure par SDS-PAGE et immunoblotting. Nous croyons que ces méthodes combinées sont adaptés pour l’analyse des protéines épididymaires autres cibles comme un prélude à déterminer leur rôle fonctionnel dans la maturation des spermatozoïdes et/ou de stockage.
Introduction
Les spermatozoïdes de toutes les espèces mammifères acquièrent la possibilité d’afficher la motilité progressive vers l’avant et de féconder un ovule durant leur descente prolongée par le biais de l’épididyme, une région hautement spécialisée du système conduit extra testiculaire mâle, qui peut prendre de 7 à 14 jours pour naviguer (selon les espèces)1. En raison de l’extrême condensation de la chromatine paternelle et l’effusion de la majorité du cytoplasme qui accompagne la cytodifférenciation des spermatozoïdes dans les testicules, leur maturation fonctionnelle ultérieure est conduite exclusivement par leur interaction avec le microenvironnement dans l’épididyme. Ce milieu est, à son tour, créé par l’activité de sécrétion et d’absorption du soma épididymaire doublure et affiche un niveau exceptionnel de segment segment variante1. Ainsi, les segments plus actifs sur le plan de la synthèse des protéines et la sécrétion sont celles qui sont situées dans la partie proximale de l’ épididyme (à savoir, le caput et corpus)2. Cette activité reflète le profil fonctionnel des spermatozoïdes, avec le début de premières cellules pour afficher les caractéristiques de compétence fonctionnelle (i.e., motilité progressive et la capacité de lier aux glycoprotéines acides solubilisée zona) suivant leur passage dans l’ épididyme de caput3. Ces attributs fonctionnels continuent de développer avant d’atteindre un niveau optimal, comme les spermatozoïdes atteignent le segment distal dans l’épididyme (cauda), dans lequel ils sont stockés dans un état de repos dans la perspective de l’éjaculation. La formation et le maintien de ce réservoir de stockage de sperme est aussi intimement liée à l’épithélium de la muqueuse, qui dans la cauda est dominé par la forte activité absorbante4,5. Bien que les différences anatomiques ont été déclarés6,7,8, ce régionalisé division du travail semble être une caractéristique de l’épididyme qui est partagé par la majorité des espèces de mammifères étudiés à ce jour, y compris notre propre9,10. En effet, d’un point de vue clinique, il est connu que la dysfonction épididymaire apporte une contribution importante à l’étiologie du facteur masculin infertilité11, mettant ainsi en évidence l’importance de comprendre la régulation de ce tissu spécialisé.
Il est donc regrettable que notre compréhension de la physiologie dans l’épididyme et les mécanismes qui régulent les phases séquentielles de la maturation des spermatozoïdes et de stockage au sein de ce tissu, restent à être entièrement résolus. Parmi les facteurs contributifs, limitantes avancées de la recherche dans l’épididyme sont la complexité globale de ce tissu et la connaissance des mécanismes qui exercent un contrôle réglementaire sur son microenvironnement luminale. Anatomiquement, nous savons qu’au-delà de la distinction des segments caput, corpus et cauda, l’épididyme peut être subdivisé en plusieurs zones (Figure 1 a), chacune séparées par des septa12 et caractérisée par des profils distincts de gènes/protéines expression13,14,15,16,17,18. En effet, sur la base de profilage détaillées transcriptionnelle segmentaire d’expression de gène dans l’épididyme, comme 6 et 9 zones épididymaires distinctes ont été signalés dans les modèles de souris et le rat, respectivement19,20. Une telle complexité sans doute reflète la composition de l’épididyme soma, un épithélium pseudostratifié comprenant de nombreux types de cellules différents ; chaque diffèrent en ce qui concerne leurs activités d’abondance, la distribution et sécrétoire/absorption le long des voies. Ainsi, les cellules principales sont de loin le plus abondant des cellules épididymaires type constituant plus de 80 % de toutes les cellules épithéliales. En conséquence, cellules principales sont responsables de la majeure partie des protéines épididymaires la biosynthèse et la sécrétion5. En revanche, la population de cellules claires, qui comptent comme le type de cellule deuxième plus abondant dans le soma épididymaire, est principalement liée à l’absorption sélective des composants luminales et l’acidification de ce micro-environnement5. Ajoutant une autre couche de complexité, androgènes et autres facteurs de lumicrine d’origine testiculaire exercent un contrôle différencié sur chacun de ces types de cellules épididymaires selon leur positionnement le long du tractus.
Malgré les limitations imposées par une telle complexité, des percées significatives continuent d’être déployés en résoudre la base mécaniste de la fonction épididymaire. Des clés de ces études a été l’application de stratégies avancées spectrométrie de masse à établir des inventaires à grande échelle du protéome dans l’épididyme, en tandem avec des analyses détaillées des protéines individuelles choisis parmi ces enquêtes initiales. Une illustration de cette approche est notre caractérisation récente de la famille DNM de mechanoenzymes dans la souris modèle21. Notre intérêt initial en DNM a été alimentée par sa double action dans l’accouplement d’exo – et processus de l’endocytose. S’appuyant sur ces observations, nous avons pu démontrer que les trois isoformes canoniques de DNM (DNM1 – DNM3) sont fortement exprimés dans l’épididyme de souris et convenablement positionnés pour s’acquitter des rôles régulateurs dans la sécrétion de protéines et l’absorption21 . En outre, nous avons pu clairement différencier chaque isoforme DNM sur la base de leur localisation cellulaire et subcellulaire, suggérant ainsi qu’ils possèdent complémentaires, par opposition aux activités redondantes, au sein de l’ épithélium épididymaire21.
Nous décrivons ici la méthodologie expérimentale employée pour l’étude de l’expression DNM dans l’épididyme de souris avec l’espoir que cette information va trouver une application plus large dans la caractérisation de protéines épididymaires alternatifs et ainsi contribuer à notre compréhension de la fonction de cet élément important du système reproducteur masculin. Plus précisément, nous décrivons l’élaboration d’une méthodologie robuste pour l’immunofluorescence étiquetage des protéines cibles dans les sections épididymaires paraffine et la détection ultérieure de la distribution spatiale de ces protéines par immunofluorescence microscopie. On trouvera plus loin nos protocoles récemment optimisé22 pour l’isolement et la caractérisation des epididymosomes ; petites vésicules exosome-like qui constituent des éléments essentiels du profil épididymaire sécrétoire et semblent tenir un rôle important dans la promotion de maturation des spermatozoïdes23. Comme une approche complémentaire, nous décrivons également la détection par immunofluorescence des protéines cibles dans une lignée de cellules immortalisées souris caput épithélium épididymaire (mECap18) et l’utilisation de cette ressource comme un modèle pour explorer la régulation de l’épididyme in vitrode l’activité sécrétoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ces études incorporé l’utilisation de tissu épididymaire fixe de Bouin, qui avait été soumis à l’enrobage de paraffine et de protocoles standard de l’amputation. Solution de fixation de Bouin comprend un mélange de formaldéhyde, l’acide picrique et l’acide acétique, chaque composant ayant une fonction spécifique et complémentaire. Ainsi, formaldéhyde réagit avec les amines primaires pour former des liaisons transversales des protéines, acide picrique pénètre lentement le tissu formant des sels e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimerait la National Health and Medical Research Conseil de projet Australie Grant APP1103176 pour la prise en charge de ce travail.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
Referências
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