Análisis de la secreción y síntesis de la proteína Epididimal
Summary
Aquí, divulgamos la localización de la inmunofluorescencia de Dynamín para ilustrar los protocolos para la detección de proteínas en secciones de epidídimo de ratón embebido en parafina y las de una línea de células epidídimo inmortalizadas (mECap18). También se describen los protocolos para el aislamiento de proteínas secretoras de fluido Epididimal y medios condicionados de la célula.
Abstract
El epidídimo mamífero genera uno de los más complejos líquidos intramural de cualquier glándula endocrina para apoyar la maduración post-testicular y el almacenamiento de espermatozoides. Tal complejidad se presenta debido a la actividad secretora y absortiva combinada de las células epiteliales de revestimiento. Aquí, describimos las técnicas para el análisis de la secreción y síntesis de la proteína Epididimal centrándose en la familia de proteínas modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPasas grandes que tienen el potencial para regular eventos tráfico bidireccional de membrana. Para el estudio de expresión de la proteína en tejido Epididimal, describimos la metodología robusta para inmunofluorescencia etiquetado de proteínas blanco en secciones parafina-encajadas y la posterior detección de la distribución espacial de estas proteínas a través de microscopia de la inmunofluorescencia. También describimos la metodología optimizada para el aislamiento y la caracterización de los exosomas como vesículas, conocido como epididymosomes, que son secretadas en el lumen del epidídimo para participar en la comunicación intercelular con maduración células de la esperma. Como un enfoque complementario, también Describimos la detección de inmunofluorescencia de las proteínas de la blanco en una línea de células de ratón inmortalizó SV40 caput epitelio Epididimal (mECap18). Además, discutimos la utilidad de la línea celular de mECap18 como un modelo adecuado en vitro con el cual explorar la regulación de la actividad secretora de epidídimo. Para ello, se describen los requerimientos de cultivo para el mantenimiento de la línea de celular mECap18 y el uso de regímenes de inhibición farmacológica selectiva que son capaces de influir en su perfil de la proteína secretora. Los últimos son fácilmente evaluaron por cosecha del medio de cultivo condicionado, concentración de proteínas secretadas mediante precipitación de ácido tricloroacético/acetona y su posterior análisis mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Sostenemos que estos métodos combinados son adecuados para el análisis de objetivos alternativos proteína Epididimal como preludio para determinar su papel funcional en la maduración del esperma o almacenamiento.
Introduction
Los espermatozoides de todas las especies mamíferas adquieran el potencial para mostrar motilidad progresiva hacia adelante y fertilizar un óvulo durante su descenso prolongado por el epidídimo, una región altamente especializado del sistema masculino conducto extra testiculares, que pueden 7-14 días para navegar (dependiendo de la especie)1. Debido a la extrema condensación de la cromatina paterna y el derramamiento de la mayoría del citoplasma que acompaña el cytodifferentiation de espermatozoides en los testículos, su posterior maduración funcional está impulsado exclusivamente por su interacción con el microambiente epidídimo. Este medio es, a su vez, creado por la actividad secretora y absortiva del soma epididymal de guarnición y muestra un nivel excepcional de segmento variación1. Así, los segmentos más activos en cuanto a la síntesis de proteínas y la secreción son los situados en la porción proximal del epidídimo (es decir, la cabeza y corpus)2. Esta actividad refleja el perfil funcional de los espermatozoides, con el primer principio de las células para mostrar características distintivas de la competencia funcional (es decir., motilidad progresiva y la capacidad de enlazar a glicoproteínas de la zona ácido solubilizado) siguientes sus paso por el epidídimo cápita del3. Estos atributos funcionales continúan desarrollándose antes de llegar a niveles óptimos mientras los espermatozoides alcanzan el segmento distal del epidídimo (cauda), en donde se almacenan en un estado quiescente en la preparación para la eyaculación. La formación y el mantenimiento de este depósito del almacenaje de la esperma está también íntimamente ligada al epitelio de revestimiento, que en la cauda está dominado por la fuerte actividad de absorción4,5. Aunque las diferencias anatómicas se han reportado6,7,8, tal división regionalizada del trabajo parece ser una característica de epidídimo que es compartido entre la mayoría de las especies de mamíferos estudiados hasta la fecha, incluyendo nuestra propia de9,10. De hecho, desde una perspectiva clínica, se conoce que la disfunción epidídimo hace una importante contribución a la etiología del factor masculino infertilidad11, subrayando así la importancia de comprender la regulación de este tejido especializado.
Por lo tanto, es lamentable que nuestra comprensión de la fisiología del epidídimo y los mecanismos que regulan las fases secuenciales de la maduración de espermatozoides y almacenamiento dentro de este tejido, quedan por resolverse completamente. Entre los factores que contribuyen, limitando los avances en investigación epidídimo son la complejidad total de este tejido y conocimiento de los mecanismos que ejercen control regulador sobre su microambiente luminal. Anatómicamente, sabemos que más allá de la distinción de segmentos corpus, caput y cauda, el epidídimo se puede subdividir en varias zonas (figura 1A), cada uno separados por septos12 y caracterizado por perfiles discretos de gene/proteína 14,13,15,16,de expresión de17,18. De hecho, sobre la base de detallados transcripcional de perfiles de expresión génica segmentaria en el epidídimo, como 6 y 9 zonas epidídimo se han divulgado en los modelos de ratón y rata, respectivamente19,20. Tal complejidad probablemente refleja la composición del epidídimo soma, un epitelio seudoestratificado compuesto por numerosos tipos celulares diferentes; cada diferente con respecto a sus abundancia, distribución y secreción/absorción actividades a lo largo de la longitud de la zona. Así, las células principales son por mucho los más abundantes células epidídimo tipo constituyendo más del 80% de todas las células epiteliales. En consecuencia, las células principales son responsables de la mayor parte de la biosíntesis y la secreción de proteína Epididimal5. En contraste, la población de células claras, que alinea como el segundo más abundante tipo de célula en el epidídimo soma, principalmente participan en la absorción selectiva de componentes luminales y la acidificación de este microambiente5. Añadiendo otro nivel de complejidad, los andrógenos y otros factores de lumicrine de origen testicular ejercen control diferencial sobre cada uno de estos tipos de células epidídimo dependiendo de su posición a lo largo de la zona.
A pesar de las limitaciones impuestas por tal complejidad, incursiones significativas se siguen haciendo en resolver la base mecanicista de la función del epidídimo. Una clave a estos estudios ha sido la aplicación de estrategias avanzadas de espectrometría de masas para establecer inventarios de amplia escala del proteoma epididymal, junto con análisis detallados de proteínas individuales seleccionados entre estos estudios iniciales. Una ilustración de ello es la reciente caracterización de la familia de la DNM de mechanoenzymes en el ratón modelo21. Nuestro interés inicial en la DNM fue alimentado por su doble acción en el acoplamiento de procesos endocytotic y exo. Basándose en estas observaciones, hemos sido capaces de demostrar que las tres isoformas canónicas de la DNM (DNM1 – DNM3) son altamente expresadas en el epidídimo de ratón y colocadas de forma apropiada para cumplir con funciones reguladoras en la secreción de la proteína y absorción de21 . Por otra parte, hemos sido capaces de diferenciar claramente cada isoforma de la DNM en base a su localización celular y subcelular, así sugiriendo que poseen complementarias frente a actividad redundante, en el epitelio Epididimal21.
Aquí, describimos la metodología experimental empleada para el estudio de la expresión de la DNM en el epidídimo de ratón con la esperanza de que esta información se encuentra aplicación en la caracterización de proteínas epididimales alternativas y así contribuir a nuestra comprensión de la función de este importante elemento del tracto reproductivo masculino. Específicamente, se describe el desarrollo de una metodología robusta para inmunofluorescencia etiquetado de proteínas blanco en secciones parafina-encajadas de epidídimo y la posterior detección de la distribución espacial de estas proteínas por inmunofluorescencia microscopia. Documentamos más nuestros protocolos recientemente optimizado22 para el aislamiento y caracterización de epididymosomes; exosomas como pequeñas vesículas que constituyen elementos clave del perfil secretor epididymal y parecen sostener un papel destacado en la promoción de la maduración de espermatozoides23. Como un enfoque complementario, también Describimos la detección de inmunofluorescencia de las proteínas de la blanco en una línea de células inmortalizadas ratón caput epitelio Epididimal (mECap18) y el uso de este recurso como un modelo con el cual explorar la regulación de epidídimo in vitrode la actividad secretora.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estos estudios incorporan el uso de tejido de epidídimo fijo de Bouin que había sido objeto de inclusión en parafina y protocolos de seccionamiento. Solución fijador de Bouin compone de una mezcla de formaldehído, el ácido pícrico y el ácido acético, con cada componente tiene una función específica y complementaria. Por lo tanto, formaldehído reacciona con aminas primarias para formar enlaces cruzados proteína, ácido pícrico penetra lentamente el tejido formando sales y por lo tanto, la coagulación de pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer la National Health and Medical Research Consejo de Australia proyecto Grant APP1103176 de apoyo a este trabajo.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
Referências
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