Analys av Epididymal proteinsyntes och utsöndring
Summary
Vi rapporterar här, immunofluorescens localizationen av dynamin att illustrera protokollen för påvisande av proteiner i paraffin-inbäddat mus epididymal sektioner och de av en förevigade epididymal cellinje (mECap18). Vi beskriver också protokoll för isolering av sekretoriska proteiner från både epididymal vätska och konditionerat cell media.
Abstract
Däggdjur bitestiklarna genererar en av de mest komplexa intraluminal vätskorna av något endokrin körtel för att stödja efter testikelcancer mognad och lagring av spermier. Sådan komplexitet uppstår på grund av den kombinera sekretoriska och absorptive aktiviteten av epitelceller lining. Här beskriver vi teknikerna för analys av epididymal proteinsyntes och utsöndringen genom att fokusera på familjen modell protein dynamin (DNM) mechanoenzymes; stora GTPases som har potential att reglera dubbelriktad membran människohandel händelser. För att studera proteinuttryck i epididymal vävnad beskriver vi robust metod för immunofluorescens märkning av målproteiner i paraffin-inbäddat sektioner och efterföljande detektion av den rumsliga fördelningen av dessa proteiner via immunofluorescens mikroskopi. Vi beskriver också optimerad metod för isolering och karakterisering av exosome som blåsor, känd som epididymosomes, som utsöndras till epididymal lumen att delta i kommunikationen med mognar spermierna. Som en kompletterande strategi beskriver vi också immunofluorescens detektion av målproteiner i en cellinje för SV40-förevigade mus caput epididymal epitelial (mECap18). Dessutom diskuterar vi verktyget av raden mECap18 cell som lämpliga in vitro- modell att utforska regleringen av epididymal sekretoriska aktivitet. För detta ändamål beskriver vi de culturing krav för underhåll av mECap18 cell linjen och användning av selektiva farmakologisk hämning regimer som kan påverka deras sekretoriska protein profil. Dessa utvärderas lätt via skörd av konditionerat odlingsmedium, koncentration av utsöndrade proteiner via triklorättiksyra/aceton utfällning och deras efterföljande analys via SDS-PAGE och immunoblotting. Vi hävdar att dessa kombinerade metoder är lämpliga för analys av alternativa epididymal protein mål som ett förspel till att bestämma deras funktionella roll i spermier mognad och/eller lagring.
Introduction
Spermier av alla däggdjursarter förvärva potential att Visa framåt progressiv motilitet och att befrukta en äggcell under sin långvariga härkomst genom bitestiklarna, en högt specialiserad region av manliga extra testikelcancer kanalsystem, som kan ta 7-14 dagar att navigera (beroende på Art)1. På grund av extrema kondensation av det paternal kromatinet och avgivande av majoriteten av cytoplasman som medföljer cytodifferentiation av spermier i testiklarna, drivs deras efterföljande funktionell mognad uteslutande av deras interaktion med den epididymal mikromiljö. Denna miljö är, i sin tur skapat av sekretoriska och absorptive aktiviteten av de foder epididymal soma och visar en exceptionell nivå av segment-segmentet variant1. De mest aktiva segment när det gäller proteinsyntesen och sekretion är således de som ligger i den proximala delen av bitestiklarna (nämligen, caput och corpus)2. Denna aktivitet speglar den funktionella profilen av spermier, med celler första början att Visa kännetecknar funktionell kompetens (dvs., progressiv motilitet och förmågan att binda till syra-solubilized zona glykoproteiner) följande deras passage genom caput bitestiklarna3. Dessa funktionella attribut fortsätta att utveckla innan nå optimala nivåer som spermier når distala epididymal segmentet (cauda), vari de lagras i en quiescent stat i beredskap för utlösning. Bildandet och underhållet av denna sperma lagringsbehållare är också intimt knuten till foder epitel, som i cauda domineras av stark absorptive verksamhet4,5. Även om anatomiska skillnader har varit rapporterade6,7,8, verkar sådana regionaliseras arbetsfördelningen vara ett kännetecken av bitestiklarna som delas bland majoriteten av däggdjursarter studerade hittills, inklusive vår egen9,10. Faktiskt från ett kliniskt perspektiv, är det känt att epididymal dysfunktion är ett viktigt bidrag till etiologin av manlig faktor infertilitet11, vilket belyser vikten av att förstå regleringen av denna specialiserade vävnad.
Det är därför beklagligt att vår förståelse av epididymal fysiologi och de mekanismer som reglerar de sekventiella faserna av spermier mognad och lagring inom denna vävnad, återstår helt. Bland de bidragande faktorerna är begränsande framsteg i epididymal forskning övergripande komplexiteten i denna vävnad och kunskap om de mekanismer som utövar tillsyn över dess luminala mikromiljö. Anatomiskt, vet vi att bortom skillnaden av caput, corpus och cauda segment, bitestiklarna kan ytterligare uppdelas i flera zoner (figur 1A), varje avskilda genom septa12 och kännetecknas av diskreta profiler av genen och protein uttryck13,14,15,16,17,18. Faktiskt, på grundval av detaljerade transkriptionell profilering av segmentell genuttryck i bitestiklarna, så många som 6 och 9 distinkta epididymal zoner har rapporterats hos mus och råtta modellerna, respektive19,20. Sådan komplexitet förmodligen återspeglar sammansättningen av den epididymal soma, en pseudostratified epitel bestående av många olika celltyper; varje olika vad gäller överflöd, distribution och sekretoriska/absorptive verksamheten längs längden av tarmkanalen. Huvudsakliga celler är alltså överlägset den mest förekommande epididymal cell typ som utgör uppemot 80% av alla epitelceller. Följaktligen är huvudsakliga celler ansvariga för huvuddelen av epididymal protein biosyntes och sekretion5. Däremot är befolkningens klarcellig, som rankas som den näst vanligast förekommande celltypen inom den epididymal soma, primärt inblandade i selektiv absorption av luminala komponenter och försurning av denna mikromiljö5. Lägga till en annan nivå av komplexitet, utöva androgener och andra lumicrine faktorer av testikelcancer ursprung differentiell kontroll över var och en av dessa epididymal celltyper beroende på deras placering längs tarmkanalen.
Trots de begränsningar som införts av sådan komplexitet, betydande inbrytningar i fortsättningen göras till lösa den mekanistiska grunden för epididymal funktion. En nyckel till dessa studier har varit tillämpning av avancerad masspektrometri strategier att upprätta storskaliga inventeringar av de epididymal proteomet, tillsammans med detaljerade analyser av enskilda proteiner utvalda bland dessa inledande undersökningar. En illustration av detta tillvägagångssätt är vår senaste karakterisering av DNM familjen av mechanoenzymes i mus modell21. Vårt inledande intresse för DNM drevs av dess dubbelverkande i kopplingen av exo- och endocytotic processer. Bygga på dessa observationer, har vi kunnat visa att de tre kanoniska isoformerna av DNM (DNM1 – DNM3) är starkt uttryckt i mus bitestiklarna och lämpligt placerade för att uppfylla regulatoriska roller i protein sekretion och absorption21 . Dessutom kunde vi tydligt skilja varje DNM isoform på grundval av deras cellulära och sub cellulär lokalisering, vilket tyder på att de har kompletterande, i motsats till redundant, aktivitet inom den epididymal epitel21.
Här beskriver vi de experimentell metodik som används för studier av DNM uttryck i mus bitestiklarna med hopp om att denna information kommer att hitta bredare tillämpning i karakterisering av alternativa epididymal proteiner och därmed bidra till vår förståelse för funktionen av denna viktiga del av manliga genitalia. Specifikt, beskriver vi utvecklingen av robust metod för immunofluorescens märkning av målproteiner i paraffin-inbäddat epididymal sektioner och efterföljande detektion av den rumsliga fördelningen av dessa proteiner via immunofluorescens mikroskopi. Vi ytterligare dokumentera våra nyligen optimerad protokoll22 för isolering och karakterisering av epididymosomes; små exosome-liknande blåsor som utgör viktiga delar av epididymal sekretoriska profilen och verkar hålla en framträdande roll i att främja spermier mognad23. Som en kompletterande strategi beskriver vi också immunofluorescens detektion av målproteiner i en cellinje för förevigade mus caput epididymal epitelial (mECap18) och användningen av denna resurs som en modell att utforska regleringen av epididymal sekretoriska aktivitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dessa studier ingår användning av Bouins fasta epididymal vävnad som hade utsatts för paraffin inbäddning och snittning standardprotokoll. Bouins fixativ lösningen består av en blandning av formaldehyd, pikrinsyra och ättiksyra, med varje komponent för att ha ett specifikt och kompletterande funktion. Således, formaldehyd reagerar med primära amines bildar protein tvärbindningar, pikrinsyra penetrerar sakta vävnaden bildar salter och därmed koagulation av grundläggande proteiner och omvänt, ättiksyra sna…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna de nationella hälso- och medicinsk forskning rådet av Australien Project Grant APP1103176 till stöd för detta arbete.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
Referências
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf’s thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
- Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell’Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
