1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施
Summary
従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1 つの設定にします。
Abstract
蛍光顕微鏡は、その場で生体分子の検出し、その動態とリアルタイムの相互作用を監視する強力なツールです。従来のエピ蛍光顕微鏡に加えて様々 なイメージング技術は実験の特定の目標を達成するために発達しました。Å の解像度と単一分子検出に基づく分子間相互作用の構造変化とに報告される単一分子蛍光共鳴エネルギー移動 (smFRET) を含むいくつかの広く使われている技術超解像度 (SR) イメージング、回折限界顕微鏡に比べて twentyfold に空間分解能約 10 を高めることができます。従来エピ蛍光イメージング、分子検出に基づく放射光イメージング、マルチカラー単一分子検出など、1 つの顕微鏡の複数の撮像方法をマージ顧客設計統合システムを紹介します。smFRET イメージングを含みます。光学素子を切り替えることにより、簡単かつ再現性をもってさまざまな撮像方法を実現できます。このセットアップは、ルーチンと多様なイメージング実験コストの削減と建物の個々 の目的別顕微鏡に比べて、領域の必要性と生物科学のすべての研究所によって採用する簡単です。
Introduction
蛍光顕微鏡は現代生物学研究のための重要なツールであり、蛍光イメージングは多くの生物学研究所で定期的に実行されます。Fluorophores が付いている興味の分子をタグ付け、直接顕微鏡の下で視覚化し、ローカリゼーション、構造、相互作用、およびアセンブリ状態で体内または体外で経時変化を記録できます。従来の蛍光顕微鏡は横方向に 200 ~ 300 nm と 500 ~ 700 nm 軸方向1、2、そして、したがっての 100 s でイメージングに限る回折限界の分解能があります。ナノメートル-ミクロン スケール。分子集合体または組織の細部を明らかにするため、回折限界を破ることができる様々 な SR 系が開発されています。SR を達成するために使用される戦略は、誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡3,4や構造化照明顕微鏡 (SIM)5,6,などの非線型光学効果7、確率光再建顕微鏡 (嵐)8とセンサー ローカリゼーション顕微鏡 (パーム)9MINFLUX10など、両方の組み合わせなど、単一の分子の検出を確率。これらの SR 系の中で、単一分子の顕微鏡のセットアップから単一分子検出に基づく SR 顕微鏡を比較的簡単に変更できます。反復的な活性化と活性型蛍光タンパク質 (FPs) または興味の分子タグ写真切替可能な染料のイメージングは、空間分解能は 10-20 nm11を達することができます。分子間相互作用と立体構造情報を得るためには、リアルタイム ・ オングストローム-ナノメートル分解能動態が必要です。smFRET12,13は、この解像度を達成するために 1 つのアプローチです。一般に、生物学的興味に応じて、空間解像度の異なる撮像方法が必要です。
通常、各タイプのイメージ投射では、特定の励起および/または放射光の構成が必要です。例えば、単一分子検出のための最も一般的に使用される照明手法の 1 つは特定の励起角度がプリズムや対物レンズを通じて達成する必要があります内部全反射 (TIR) を通じてです。・空間的分離、電子-乗算の電荷結合素子 (EMCCD)、ミラー、ダイクロイック ビームスプリッターのセットを得ることができるのさまざまな部分に指示必要があります smFRET 検出、ドナーとアクセプターの染料からの排出量排出パスに配置されます。3 次元 (3-D) 排出パスの非点収差の影響を引き起こすこと SR イメージング、14シリンドリカル レンズなどの光学部品が必要です。したがって、自作や市販の統合された顕微鏡は、通常、機能的イメージング法の種類ごとに特化した、同じセッティングのさまざまなイメージング方法を切り替える柔軟ではありません。3 つの異なる撮像方法間調整で再現可能なスイッチを提供するコスト効率の高いハイブリッド システムの紹介: 単一分子検出に基づく SR の回折限界解像度と、従来のエピ蛍光イメージングイメージングおよびマルチカラー単一分子検出、smFRET イメージング (図 1 a) を含みます。具体的には、ここに示す設定を含む多波長励起入力レーザのファイバー結合型、商業照明アームにより、励起のパスにプログラム epi モードと TIR モードを切り替える、励起角度のコントロール。排出パス 3次元イメージングのための顕微鏡体内リムーバブル自作円筒レンズ カセットを配置し、複数の発光チャンネルを検出する選択的に有効にできる、EMCCD カメラ手前にある商業ビームスプリッター同時に。
Protocol
1. 顕微鏡設計・組立 励起パス注: レーザー、差動干渉の対照 (DIC) のコンポーネント、顕微鏡本体、照明アームに、励起パスが含まれます。 振動分離光学テーブルを準備します。たとえば、48 × 96 × 12′ の構造減衰テーブルは、すべてのコンポーネントの十分なスペースを与えます。注: 構築 (例えば、21.4 ± 0.55 ° C) 温度制御付きの部屋の設定です。温度…
Representative Results
この顕微鏡では、柔軟性と再現性のあるさまざまなイメージング方法を切り替えることができます。ここで各イメージング モジュールで収集したサンプル画像を紹介します。 図 5は、SR 取得中に点滅に分子の PSF を示します。最終的な SR イメージ (図 5E) を生成する何千ものよ?…
Discussion
このハイブリッド顕微鏡システムには、複数の顕微鏡を購入する必要があります。光学テーブル、テーブル ・ インストレーション、ソフトウェア、およびワークステーションを含む全ての部品の総コストは約 $230,000。マグ レンズと 3 D レンズを含むカスタム加工部品コスト約 $700 (コストは異なる機関で実際の請求によって異なります) です。典型的な市販システムのための統合単一分子検?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. f. は、サール学者プログラムおよび NIH のディレクターの新しいイノベーター賞からサポートを認めています。著者は、ポール セルビン ラボ (アーバナ平原イリノイ大学) 3 D レンズを配置するための有用な示唆をご了承ください。
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Referências
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
Citar este artigo
Park, S., Zhang, J., Reyer, M. A., Zareba, J., Troy, A. A., Fei, J. Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope. J. Vis. Exp. (140), e58320, doi:10.3791/58320 (2018).