Gjennomføre flere Imaging modi med en fluorescens mikroskopet
Summary
Her presenterer vi en praktisk guide for å bygge en integrert mikroskopi system, som sammen med konvensjonelle epi-fluorescerende bildebehandling, enkelt-molekylet gjenkjenning-basert super-oppløsning bilder og multi-farge single-molekylet gjenkjenning, inkludert Single-molekylet fluorescens resonans energioverføring bildebehandling, i et oppsett på en kostnadseffektiv måte.
Abstract
Fluorescens mikroskopi er et kraftig verktøy for å oppdage biologiske molekyler i situ og overvåke deres dynamikk og samhandling i sanntid. I tillegg til konvensjonelle epi-fluorescens mikroskopi, er ulike imaging teknikker utviklet for å oppnå bestemte eksperimentelle mål. Noen av de brukte teknikkene inkluderer enkelt-molekylet fluorescens resonans energioverføring (smFRET), som kan rapportere conformational endringer og molekylære interaksjoner med angstrom oppløsning og enkelt-molekylet gjenkjenning-basert Super-oppløsning (SR) bildebehandling, som kan forbedre romlig oppløsning ca ti å twentyfold forhold til Diffraksjon-begrenset mikroskopi. Her presenterer vi en kunde-designet integrert system, som fletter flere tenkelig metoder i en mikroskop, inkludert konvensjonelle epi-fluorescerende bildebehandling, enkelt-molekylet gjenkjenning-basert SR imaging og multi-farge single-molekylet oppdagelsen, inkludert smFRET bildebehandling. Tenkelig metoder kan oppnås raskt og reproduserbar ved å bytte optiske elementer. Dette oppsettet er enkelt å vedta ved noen forskningslaboratorium i biologi med behov for rutine og variert tenkelig eksperimenter reduserte kostnader og plass i forhold til bygge separate mikroskop for personlige formål.
Introduction
Fluorescerende imaging utføres rutinemessig i mange biologi laboratorier fluorescens mikroskop er viktige verktøy for den moderne biologisk forskningen. Ved å merke biomolecules rundt med fluorophores, kan vi direkte visualisere dem under mikroskopet og registrere tidsavhengige endringene i lokalisering, konformasjon, samhandling, og forsamlingen staten i vivo eller i vitro. Konvensjonelle fluorescens mikroskop har Diffraksjon-begrenset romlig oppløsning, som er ~ 200-300 nm i laterale retning og ~ 500-700 nm i aksial retning1,2, og er derfor begrenset til bildebehandling på 100s av nanometer til mikron skala. For å vise finere detaljer i molekylær montering eller organisasjonen, er ulike SR-microscopies som kan bryte Diffraksjon grensen utviklet. Strategier som brukes til å oppnå SR inkluderer ikke-lineære optiske effekter, som tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi3,4 og strukturert belysning mikroskopi (SIM)5,6, 7, stokastiske gjenkjenning av enkelt molekyler, som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)8 og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)9og en kombinasjon av begge, for eksempel MINFLUX10. Blant disse SR microscopies, kan enkelt-molekylet gjenkjenning-basert SR mikroskop relativt lett endres fra en enkelt-molekylet mikroskop oppsett. Med repeterende aktivisering og bildebehandling photoactivatable fluorescerende proteiner (FPs) eller Foto-valgbar fargestoffer merket på biomolecules rundt, kan romlig oppløsning nå 10-20 nm11. Dynamikk i sanntid, angstrom-til-nanometer oppløsning kreves for å få informasjon om molekylære interaksjoner og conformational. smFRET12,13 er en tilnærming til å oppnå denne oppløsningen. Vanligvis avhengig av biologiske spørsmålene rundt kreves tenkelig metoder med forskjellig romlig oppløsning.
Vanligvis for hver avbildning, er bestemte eksitasjon og/eller utslipp optiske konfigurasjon nødvendig. For eksempel er en av de mest brukte belysning metodene for single-molekylet gjenkjenning gjennom totale interne refleksjon (TIR), der en bestemt eksitasjon vinkel må oppnås gjennom et prisme eller gjennom linsen. For smFRET deteksjon må utslipp fra både giver og acceptor fargestoffer romlig atskilt og sendt til ulike deler av den elektron-multiplisere, kostnad – sammen enhet (EMCCD), som kan oppnås med et sett med speil og dichroic strålen splitters plassert i utslipp banen. For tredimensjonale (3D) kreves SR imaging, en optisk komponent, for eksempel en sylindrisk linsen14, å forårsake en astigmatisme effekt i utslipp banen. Derfor homebuilt eller kommersielt tilgjengelig integrert mikroskop er vanligvis, funksjonelt spesialisert for hver imaging metode og er ikke fleksible bytte mellom tenkelig metoder på det samme oppsettet. Her presenterer vi en kostnadseffektiv, hybridsystem som gir justerbar og reproduserbar veksler mellom tre forskjellige metoder for bildebehandling: konvensjonelle epi-fluorescerende bildebehandling med Diffraksjon-begrenset oppløsning, enkelt-molekylet gjenkjenning-basert SR bildebehandling, og multi-farge single-molekylet oppdagelsen, inkludert smFRET imaging (figur 1A). Spesielt satt opp presenteres her inneholder fiber-kombinert inngang laser for multi-farge eksitasjon og en kommersiell belysning arm i eksitasjon banen som lar programmert kontroll over eksitasjon vinkelen, bytte mellom epi- og TIR modus. I utslipp banen, en flyttbar homebuilt sylindriske linsen kassett plasseres i mikroskopet kroppen for 3D SR bildebehandling, og en kommersiell strålen splitter er plassert foran en EMCCD kamera som kan aktiveres selektivt å oppdage flere utslipp kanaler samtidig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette hybrid mikroskop systemet eliminerer behovet for å kjøpe flere mikroskop. Totalen kostnaden for alle deler, inkludert optisk tabellen, tabellen installasjon arbeid, software og workstation, er ca $230.000. Egendefinert-maskinert deler, inkludert mag linsen og 3D linsen, koste rundt $700 (kostnaden, avhengig av den faktiske belastninger på ulike institutter). Typisk kommersielt tilgjengelig integrert systemer for single-molekylet gjenkjenning-basert SR mikroskopi koster mer enn $300.000 ~ 400.000 og er ikke lett …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. anerkjenner støtte fra programmet Searle forskere og NIH nye innovatør regiprisen. Forfatterne bekrefter nyttige forslag fra Paul Selvin lab (University of Illinois, ungdomstiden) for posisjonering 3D linsen.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Referências
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
