Genomföra flera Imaging lägen med en fluorescens Mikroskop
Summary
Här presenterar vi en praktisk vägledning för att bygga ett integrerat mikroskopi system, som sammanfogar konventionella epi-fluorescerande imaging, singel-molekyl baseras på upptäckt super resolution imaging och flerfärgade singel-molekyl upptäckt, inklusive singel-molekyl fluorescens resonans energiöverföring imaging, in i en uppspänning på ett kostnadseffektivt sätt.
Abstract
Fluorescensmikroskopi är ett kraftfullt verktyg att upptäcka biologiska molekyler i situ och övervaka deras dynamik och interaktioner i realtid. Utöver konventionella epi-fluorescensmikroskopi, har olika bildgivande tekniker utvecklats för att uppnå specifika experimentella mål. Några av de allmänt använda teknikerna inkluderar singel-molekyl fluorescens resonans energiöverföring (smFRET), som kan rapportera konfirmerande förändringar och molekylära interaktioner med Ångström upplösning och singel-molekyl baseras på upptäckt super-upplösning (SR) imaging, som kan förbättra den rumsliga upplösningen som är ungefär tio till fasreaktioner jämfört med diffraktion begränsad mikroskopi. Här presenterar vi ett Kunddesignade integrerade system, som sammanfogar flera avbildningsmetoder i ett mikroskop, inklusive konventionella epi-fluorescerande imaging, singel-molekyl baseras på upptäckt SR imaging och flerfärgade singel-molekyl upptäckt, inklusive smFRET imaging. Olika avbildningsmetoder kan uppnås enkelt och reproducibly genom att byta optiska element. Detta upplägg är lätt att anta av någon research laboratory i biologiska vetenskaper med behöver rutin och olika imaging experiment till en reducerad kostnad och utrymme i förhållande till bygga separata Mikroskop för enskilda ändamål.
Introduction
Fluorescens Mikroskop är viktiga verktyg för den moderna biologiska vetenskap forskningen och fluorescerande imaging utförs rutinmässigt i många biologi laboratorier. Genom att tagga biomolekyler intresse med fluorophores, kan vi direkt visualisera dem under mikroskopet och registrera de tidsberoende förändringarna i lokalisering, konformation, interaktion, och församlingen staten in vivo eller in vitro. Konventionella fluorescens Mikroskop har en diffraktion begränsad rumslig upplösning, som är ~ 200-300 nm i lateral riktning och ~ 500-700 nm i axiell riktning1,2, och är därför begränsat till imaging på 100s av nanometer-till-micron skala. För att avslöja finare detaljer i molekylär församling eller organisation, har olika SR microscopies som kan bryta diffraktionsgränsen utvecklats. De strategier som används för att uppnå SR är icke-linjär optiska effekter, såsom stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi3,4 och strukturerade belysningen mikroskopi (SIM)5,6, 7, stokastiska detektion av enstaka molekyler, såsom stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)8 och photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)9och en kombination av båda, såsom MINFLUX10. Bland dessa SR microscopies, kan single-molekyl baseras på upptäckt SR Mikroskop ändras relativt enkelt från ett enda-molekyl Mikroskop set-up. Med repetitiva aktivering och tänkbar photoactivatable fluorescerande proteiner (FPs) eller foto-omkopplingsbar färgämnen taggade på biomolekyler sevärdheter, kan rumslig upplösning nå 10-20 nm11. För att få information om molekylära interaktioner och konfirmerande krävs dynamik i realtid, Ångström-till-nanometers upplösning. smFRET12,13 är en strategi för att uppnå denna resolution. Beroende på de biologiska frågorna av intresse behövs i allmänhet avbildningsmetoder med olika rumsliga upplösningar.
Vanligtvis för varje typ av imaging behövs specifik excitation eller utsläpp optisk konfiguration. Exempelvis är en av de vanligaste belysning metoderna för singel-molekyl upptäckt genom Totalreflexion (TIR), där en viss magnetisering vinkel måste uppnås antingen genom en prisma eller genom objektivet. För smFRET detektering måste utsläppen från både givare och acceptor färgämnen rumsligt avskiljas och riktad till olika delar av den elektron-multiplicera, kostnad – tillsammans enhet (elektrisk), som kan uppnås med en uppsättning av speglar och dichroic beam splitters placeras i sökvägen utsläpp. För tredimensionell (3-D) behövs SR imaging, en optisk komponent, såsom en cylindrisk lins14, för att orsaka en astigmatism effekt i sökvägen utsläpp. Därför hemmabyggd eller kommersiellt tillgängliga integrerat Mikroskop är, oftast, funktionellt specialiserade för varje typ av imaging metoden och är inte flexibla att växla mellan olika avbildningsmetoder på samma upplägg. Här presenterar vi ett kostnadseffektivt, hybridsystem som ger justerbar och reproducerbara växlar mellan tre olika avbildningsmetoder: konventionella epi-fluorescerande imaging med diffraktion begränsad upplösning, singel-molekyl baseras på upptäckt SR Imaging och flerfärgade singel-molekyl detektering, inklusive smFRET imaging (figur 1A). Specifikt, set-up presenteras här innehåller fiber-kopplade ingående lasrar för flerfärgade excitation och en kommersiell belysning arm i sökvägen excitation, som tillåter programmerade kontroll av magnetiseringen lutning, växla mellan epi- och TIR-läge. I sökvägen utsläpp, en flyttbar hemmabyggd cylindriska linsen kassett är placerad inom Mikroskop kroppen för 3D-SR avbildning och en kommersiell stråldelare placeras före en elektrisk kamera som selektivt kan aktiveras att upptäcka flera utsläpp kanaler samtidigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna hybrid Mikroskop system eliminerar behovet av att köpa flera Mikroskop. Den totala kostnaden för alla delar, inkluderande den optiska tabell, tabell installation arbete, programvara och arbetsstation, är ca $230.000. Custom-maskinbearbetade delar, inklusive mag linsen och 3D-lins, kosta runt $700 (kostnaden beror på de faktiska avgifterna på olika institut). Typiska kommersiellt tillgängliga integrerade system för singel-molekyl baseras på upptäckt SR mikroskopi kosta mer än $300.000 ~ 400.000 och är int…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. erkänner stöd från programmet Searle forskare och NIH regissörens nya innovatör Award. Författarna erkänner användbara förslag från Paul Selvin’s lab (University of Illinois, Urbana-Champaign) för positionering 3D-linsen.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Referências
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
