Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence
Summary
Nous présentons ici un guide pratique de construction d’un système de microscopie intégrée, qui fusionne l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, l’imagerie Super-résolution axée sur la détection de molécules simples et détection de molécules simples multicolore, y compris transfert d’énergie Single-molecule fluorescence resonance imaging, dans une mise en place d’une manière rentable.
Abstract
La microscopie de fluorescence est un outil puissant pour détecter des molécules biologiques in situ et surveiller leur dynamique et les interactions en temps réel. En plus de la microscopie épifluorescente classiques, diverses techniques d’imagerie ont été développés pour atteindre des objectifs précis expérimentales. Les techniques répandues parmi single-molecule fluorescence transfert d’énergie (smFRET), qui peut signaler des changements conformationnels et interactions moléculaires avec une résolution de l’angström et molécule unique axée sur la détection Super résolution (SR) d’imagerie, qui peut améliorer la résolution spatiale environ dix à vingt par rapport à la microscopie limitée par la diffraction. Nous présentons un système intégré de conçue par le client, qui fusionne plusieurs méthodes d’imagerie dans un microscope, y compris l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, molécule unique axée sur la détection SR imagerie et détection de molécules simples multicolore, y compris l’imagerie smFRET. Différentes méthodes d’imagerie est possible facilement et de façon reproductible par des éléments optiques de commutation. Cette configuration est facile à adopter par tout laboratoire de recherche en sciences biologiques avec un besoin de routine et diverses expériences d’imagerie à un coût réduit et espace par rapport aux microscopes distincts à des fins individuelles de construction.
Introduction
Microscopes de fluorescence sont des outils importants pour la recherche en sciences biologiques modernes et imagerie de fluorescence est effectuée régulièrement dans de nombreux laboratoires de biologie. Par le marquage de molécules d’intérêt avec des fluorophores, nous pouvons directement les visualiser au microscope et enregistrer les changements temporels dans la localisation, conformation, interaction et l’Assemblée d’état in vivo ou in vitro. Microscopes de fluorescence conventionnels ont une résolution spatiale limitée par la diffraction, c’est-à-dire ~ 200-300 nm dans le sens latéral et ~ 500-700 nm dans le sens axial1,2et sont, par conséquent, limité à l’imagerie à la 100 s de échelle de nanomètres-à-micron. Afin de révéler les détails dans l’Assemblée moléculaire ou l’organisation, les différentes microscopies SR qui peuvent briser la limite de diffraction ont été développés. Stratégies utilisées pour atteindre SR comprennent des effets optiques non linéaires, tels qu’émission stimulée épuisement (STED) microscopie3,4 et illumination structurée microscopie (SIM)5,6, 7, stochastique détection de molécules simples, tels que le stochastique optique reconstruction microscopie (tempête)8 et photoactivation localisation microscopie (PALM)9et une combinaison des deux, par exemple MINFLUX10. Parmi ces microscopies SR, microscopes de SR axée sur la détection seule molécule peuvent être modifiés relativement facilement d’une configuration de microscope de molécules simples. Avec activation répétitive et l’imagerie des protéines fluorescentes photoactivatable (FPs) ou photo-commutable colorants contenant le tag sur les biomolécules d’intérêt, une résolution spatiale peut atteindre 10 à 20 nm11. Pour obtenir des informations sur les interactions moléculaires et conformationnelle dynamique dans la résolution en temps réel, angstrom-à-nanomètre est nécessaire. smFRET12,13 est une façon d’atteindre cette résolution. En général, selon les questions biologiques d’intérêt, les méthodes d’imagerie avec différentes résolutions spatiales sont nécessaires.
En général, pour chaque type d’imagerie, configuration optique excitation et/ou d’émission spécifique est nécessaire. Par exemple, une des méthodes illumination plus couramment utilisés pour la détection de molécules simples est par le biais de la réflexion totale interne (TIR), dans lequel un angle excitation spécifique doit être réalisé à travers un prisme ou au travers de l’objectif. Pour la détection de smFRET, les émissions des colorants donneur et accepteur doivent être spatialement séparés et dirigés vers les différentes parties de l’électron-multipliant, coupled dispositif de charge (EMCCD), qui peut être réalisé avec un jeu de miroirs et de séparateurs de faisceau dichroïque placé dans le chemin d’émission. Pour en trois dimensions (3d) SR d’imagerie, un composant optique, comme une lentille cylindrique14, est nécessaire pour provoquer un effet de l’astigmatisme dans le chemin d’accès d’émission. Par conséquent, fabrication artisanale ou microscopes intégrés disponibles dans le commerce sont, généralement, fonctionnellement spécialisés pour chaque type de méthode d’imagerie et ne sont pas flexibles pour basculer entre les différentes méthodes d’imagerie sur la mise en place même. Nous présentons un système hybride rentable, qui fournit des commutateurs réglables et reproductibles entre trois différentes méthodes d’imagerie : conventionnelle épi-fluorescence imagerie avec une résolution limitée par la diffraction, axée sur la détection de molécules simples SR imagerie et détection de molécules simples multicolore, y compris smFRET imaging (Figure 1 a). Plus précisément, le montage présenté ici contient des lasers d’entrée fibre couplés pour excitation multicolore et un bras d’éclairage commercial dans le chemin de l’excitation, qui permet de programmer contrôle de l’angle de l’excitation, pour basculer entre les modes TIR et epi. Dans le chemin d’accès d’émission, une cassette de lentille cylindrique amovible fabrication artisanale est placée dans le corps de microscope pour l’imagerie 3D SR, et un séparateur de faisceau commercial est placé devant une caméra EMCCD qui peut être sélectivement activée pour détecter plusieurs canaux d’émission en même temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce système de microscope hybride élimine le besoin d’acheter plusieurs microscopes. Le coût total de toutes les parties, y compris la table optique, table installation travail, logiciel et poste de travail, est environ $ 230 000. Les pièces usinées avec personnalisé, y compris l’objectif mag et l’objectif 3D, coûtent environ 700 $ (le coût dépend des montants réels exigés dans les différents instituts). Typique disponible dans le commerce des systèmes intégrés pour la microscopie seule molécule de S…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. reconnaît le soutien du programme des boursiers Searle et le directeur du NIH New Innovator Award. Les auteurs remercient les suggestions utiles du laboratoire de Paul Selvin (University of Illinois, Urbana-Champaign) permettant de positionner la lentille 3D.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Referências
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