Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência
Summary
Aqui nós apresentamos um guia prático de construção de um sistema integrado de microscopia, que mescla imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado Super-resolução imagem e deteção de único-molécula multi cor, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência de único-molécula de imagem, em um set-up de uma maneira custo-eficiente.
Abstract
Microscopia de fluorescência é uma poderosa ferramenta para detectar moléculas biológicas em situ e monitorar suas dinâmicas e interações em tempo real. Além de microscopia convencional epi-fluorescência, várias técnicas de imagem foram desenvolvidas para alcançar objetivos específicos experimentais. Algumas das técnicas amplamente utilizadas incluem único-molécula fluorescência ressonância transferência de energia (smFRET), que pode relatar mudanças conformacionais e interações moleculares com resolução de angstrom e único-molécula detecção-baseado Super resolução (SR) de imagem, que pode aumentar a resolução espacial de aproximadamente dez a vinte vezes em comparação com microscopia difração limitada. Aqui nós apresentamos um sistema integrado de cliente-projetada, que mescla vários métodos de imagem em um microscópio, incluindo imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado SR imagem e deteção do único-molécula multi cor, incluindo smFRET de imagem. Diferentes métodos de imagem podem ser conseguidos facilmente e reproducibly elementos ópticos de comutação. Esta montagem é fácil adotar por qualquer laboratório de pesquisa em ciências biológicas com uma necessidade de rotina e diversos experimentos de imagem a um custo reduzido e espaço relativo para construir microscópios separados para fins individuais.
Introduction
Microscópios de fluorescência são ferramentas importantes para a pesquisa moderna ciência biológica e imagem fluorescente é realizada rotineiramente em muitos laboratórios de biologia. Marcando biomoléculas de interesse com fluorophores, podemos diretamente visualizá-las sob o microscópio e gravar as alterações dependentes de tempo na localização, conformação, interação e conjunto de estado em vivo ou em vitro. Microscópios de fluorescência convencional tem uma resolução espacial de difração limitada, que é ~ 200-300 nm no sentido lateral e ~ 500-700 nm no sentido axial1,2e são, portanto, limitado a imagem latente no 100s de escala de nanômetros-para-micron. A fim de revelar os detalhes mais finos na montagem molecular ou organização, desenvolveram-se vários microscopies SR que podem quebrar o limite de difração. Estratégias utilizadas para alcançar o SR incluem efeitos ópticos não lineares, tais como emissão estimulada depleção (STED) microscopia3,4 e estruturada iluminação microscopia (SIM)5,6, 7, deteção estocástica de moléculas simples, tais como reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)8 e fotoativados localização microscopia (PALM)9e uma combinação de ambos, tais como MINFLUX10. Entre estes microscopies SR, microscópios de SR de detecção-baseado de único-molécula podem ser relativamente facilmente modificados de um set-up único-molécula microscópio. Com ativação repetitiva e imagem latente de photoactivatable proteínas fluorescentes (FPs) ou foto-comutável corantes marcados em biomoléculas de interesse, resolução espacial pode chegar a 10-20 nm11. Para obter informações sobre as interações moleculares e conformacional dinâmica na resolução em tempo real, angstrom-para-nanômetros é necessária. smFRET12,13 é uma abordagem para alcançar esta resolução. Geralmente, dependendo das questões biológicas da interesse, são necessários métodos de imagens com diferentes resoluções espaciais.
Normalmente, para cada tipo de imagem, configuração específica da excitação e/ou de emissão óptica é necessária. Por exemplo, um dos métodos de iluminação mais comumente usados para a deteção de único-molécula é através da reflexão interno total (TIR), em que um ângulo específico da excitação precisa ser alcançado através de um prisma ou através da lente objetiva. Para a deteção de smFRET, as emissões do dador e do aceitador corantes precisam ser espacialmente separados e direcionados para diferentes partes do elétron-multiplicando, dispositivo de carga acoplada (EMCCD), que pode ser conseguido com um conjunto de espelhos e divisores de feixe dicroicas colocado no caminho de emissão. Para tridimensional (3D) SR de imagem, um componente ótico, como uma lente cilíndrica14, é necessária para causar um efeito de astigmatismo na trajectória de emissões. Portanto, homebuilt ou microscópios integrados comercialmente disponíveis são, geralmente, funcionalmente especializados para cada tipo de método de imagem e não são flexíveis para alternar entre diferentes métodos de imagem na mesma afinação. Aqui nós apresentamos um sistema híbrido cost-effective, que fornece opções ajustáveis e reprodutíveis entre três diferentes métodos de imagem: imagem de epi-fluorescente convencional com resolução de difração limitada, SR baseado na deteção do único-molécula imagem e detecção de único-molécula multi cor, incluindo smFRET de imagem (figura 1A). Especificamente, a afinação aqui apresentada contém fibra acoplados entradas lasers para excitação de várias cor e um braço de iluminação comercial no caminho de excitação, que permite programar controle do ângulo de excitação, para alternar entre modo TIR e epi. No caminho de emissão, um estojo de lente cilíndrica de homebuilt removível é colocado dentro do corpo do microscópio para imagens 3D de SR, e um divisor de feixe comercial é colocado antes de uma câmera EMCCD que pode ser habilitada seletivamente para detectar múltiplos canais de emissão ao mesmo tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este sistema de microscópio híbrido elimina a necessidade de adquirir vários microscópios. O custo total para todas as partes, incluindo a mesa óptica, trabalho de instalação de mesa, software e estação de trabalho, é de cerca de US $230.000. Peças usinadas personalizado, incluindo o mag lente e lente 3D, custam cerca de US $700 (o custo varia de acordo com as cargas reais nos diferentes institutos). Típico comercialmente disponíveis sistemas integrados para microscopia de SR de detecção-baseado de único-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. reconhece o apoio do programa estudiosos Searle e o diretor do NIH New Innovator Award. Os autores reconhecem sugestões úteis do laboratório de Paul Selvin (Universidade de Illinois, Urbana-Champaign) para posicionar a lente 3D.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Referências
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